HPLC-ELSD测定银杏叶刺梨胶囊中银杏萜类内酯的含量

周亚杰，冯鹏，郭原，冯敏

（南京中科药业有限公司，江苏南京210008）

保健食品银杏叶刺梨胶囊的配方组成为银杏叶提取物、刺梨汁粉、微晶纤维、糊精和硬脂酸镁等。前期的研究表明该配方能改善免疫性肝损伤大鼠肝功能和改善四氯化碳引起的小鼠肝损伤，并且在两种药理模型中复方作用均优于单一银杏叶提取物[1-2]。银杏叶提取物含有黄酮类、萜类内酯、有机酸等多种成分。具有抗氧化、改善循环、抗血小板聚集、保护神经系统等主要药理作用[3]。临床上广泛用于治疗心脑血管疾病，并具有较显著的效果[4]，广泛用于药品、保健食品中，其中以银杏叶提取物为主要功能成分的保健食品有200多个。银杏萜类内酯是银杏叶提取物的重要活性成分之一，其中，白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C是常用的检测指标，用来控制银杏叶提取物和银杏叶制剂的品质[5]。银杏内酯为血小板活化因子拮抗剂，可用于治疗脑血栓、心机梗塞等心脑血管疾病[6]。银杏叶萜类内酯的分析检测方法包括高效液相色谱-示差折光检测器法（high performance liquid chromatography-refractive index，HPLC-RI）[7]、毛细管气相色谱法[8]和超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry，UPLC-MS-MS）[9]等。也有研究者建立了“一测多评”的方法，以白果内酯为内参物，计算银杏内酯A、B、C的校正因子，测得4个萜类内酯的含量[10]。本试验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）同时测定银杏叶刺梨胶囊中银杏萜类内酯的含量，为该产品的质量控制提供数据。含银杏叶提取物的保健食品多以银杏黄酮或者总黄酮为指标控制产品的质量，较少以银杏萜类内酯的含量为指标控制产品质量[11]。试验建立的方法可用于以银杏叶提取物为功能成分的保健食品的质量分析。

1 材料与设备

1.1 试剂与材料

盐酸、醋酸钠、乙酸乙酯（分析纯）：南京市化学试剂公司；甲醇（色谱纯）：山东禹王实业有限公司化工分公司；纯净水：市售包装饮用纯净水；白果内酯（批号110865-201306）、银杏内酯 A（批号 110862-201310）、银杏内酯B（批号110863-201410）、银杏内酯C（批号110864-201307）：中国食品药品检定研究院；复方银杏刺梨胶囊（批号分别为 170101，170102，170103）：南京中科药业有限公司自制。

1.2 仪器

Waters E2695自动进样高效液相色谱仪（配有Alltech ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器）：Waters公司；AG285型电子天平（万分级）、MS105DU型电子天平（十万分级）：梅特勒-托利多有限公司；KQ-250DB型数显超声波清洗器：昆山市超声仪器公司。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水 =30 ∶70（体积比），柱温为35℃，流速为1.0 mL/min；ELSD检测器雾化温度100℃，雾化气为空气，气流速度2.5 L/min[12-13]。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取白果内酯（bilobalide，BB）5.47 mg、银杏内酯A（ginkgolide A，GA）5.22 mg、银杏内酯B（ginkgolide B，GB）5.40 mg、银杏内酯 C（ginkgolide C，GC）5.46mg，置于5mL容量瓶中，加甲醇使超声溶解并稀释至刻度，混匀，得标准储备液，4℃冰箱保存备用。

2.3 供试品溶液的制备

参照《中国药典》银杏叶提取物中的方法进行供试品溶液的制备，具体如下：取银杏叶刺梨胶囊内容物，研细，精密称定1.0 g内容物粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 250 W，频率 33 kHz）20 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，挥干甲醇，残渣加水10 mL，置水浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次（分别15、10、10、10 mL），合并提取液，用 5%醋酸钠溶液 20 mL洗涤，分取醋酸钠溶液，再用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用纯净水洗涤2次，每次20 mL，分取纯净水，用乙酸乙酯10 mL洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液[14]。

2.4 线性关系的考察

取对照品标准储备液，注入液相色谱仪，进样体积分别为 4、6、8、10、12 μL，分别以 BB、GA、GB、GC 峰面积的自然对数为纵坐标（Y），各对照品进样浓度的自然对数为横坐标（X）做标准曲线。

2.5 专属性试验

按比例制备不含银杏叶提取物的阴性样品，精密称取阴性样品粉末2.0 g，按照2.3方法制备阴性对照样本供试品液。

2.6 精密度试验

取2.2中的标准储备液，按2.1色谱条件连续进样6次。

2.7 稳定性试验

取银杏叶刺梨胶囊（批号：170101）内容物，按照2.3方法制备供试品溶液，分别在溶液制备后0、2、4、6、8、10 h 进样，进样体积为 10 μL，测定峰面积。

取对照品标准储备液，注入液相色谱仪，进样体积为 10 μL。分别在 0、2、4、6、8、10 h 进样，测定峰面积。

2.8 重复性试验

取银杏叶刺梨胶囊（批号：170101）内容物，按照2.3方法制备供试品溶液6份，按照2.1的色谱条件测定总萜内酯的含量。

2.9 加标回收率试验

精密称取银杏叶刺梨胶囊（批号：170101）内容物0.5 g，共6份，再加对照品适量，按照2.3方法制备供试品溶液，按照2.1色谱条件测定含量，计算回收率。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

得回归方程分别为YBB=1.534 9X+7.106 6，R2=0.999 6；YGA=1.765 6X+6.881 1，R2=0.999 2；YGB=1.637 0X+6.827 0，R2=0.999 0；YGC=1.590 0X+6.961 1，R2=0.999 3。结果如图1。

3.2 专属性试验结果

阴性样品色谱图中在萜类内酯相应保留时间上没有干扰峰，说明在本条件下其他成分对萜类内酯含量测定无干扰结果见图2。

图1 白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的线性回归曲线Fig.1 Linear regression curve of BB，GA，GB，and GC

图2 阴性样本、混合对照品和样品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of blank sample，mixed references and samples

3.3 测试方法的精密性

测定BB、GA、GB、GC峰面积的RSD分别为2.50%、1.83%、2.26%和1.78%，均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

3.4 测试方法的稳定性

银杏叶刺梨胶囊（批号：170101）供试品测定结果为BB、GA、GB、GC峰面积的RSD分别为2.72%、1.75%、2.28%、1.99%，均小于3.00%，表明供试品溶液在室温（18℃～26℃）条件下放置10 h稳定。

对照品标准储备液测定结果为BB、GA、GB、GC峰面积的RSD分别为2.22%、1.95%、2.08%、1.79%，均小于3.00%，表明对照品溶液在室温（18℃～26℃）条件下放置10 h稳定。

3.5 重复性试验结果

测定6份样本中总萜内酯的含量分别为1.661 1、1.630 1、1.708 9、1.736 6、1.740 7、1.641 1 g/100 g，平均值为1.686 4 g/100 g，RSD为2.89%，小于3.00%，表明该方法重复性好。

3.6 加标回收率

加样回收率数据见表1，平均回收率在95%～105%之间，RSD均小于3.00%。表明试样方法满足加标回收。

3.7 样品的测定

取3批银杏叶刺梨胶囊（批号分别为170101、170102、170103），每批样本同时测试两份，按照2.3方法制备供试品溶液，依法进样测定。每份样本进样两次，取平均值。银杏叶萜类内酯含量=（白果内酯含量+银杏内酯A含量+银杏内酯B含量+银杏内酯含量），结果见表2。

表1 银杏叶刺梨胶囊萜类内酯加样回收率试验Table 1 Recovery data of ginkgolides in ginkgo leaf and Rosa roxburghii capsule

表2 HPLC法测定银杏总萜内酯含量Table 2 The content of ginkgolides

4 结论

银杏叶提取物在银杏叶刺梨胶囊中占比为26%，根据《中国药典》对银杏叶提取物的质量要求[12]，其中萜类内酯含量需要≥6.0%，理论上银杏叶刺梨胶囊中银杏叶萜类内酯含量需≥1.56%。本试验测定结果表明3批次样品的银杏叶萜类内酯含量分别为1.97%、2.35%、2.07%，平均值为2.13%，均大于理论值。考虑到大生产时，各批次间的差异，依据含量限定值为实测值75%～80%的原则，可将银杏叶刺梨胶囊中总萜内酯含量限定值定为≥1.70 g/100 g。本试验建立的方法萜类内酯附近无杂峰的干扰，能准确测定银杏叶刺梨胶囊中萜类内酯的含量。本试验建立的方法可用于含有银杏叶提取物的保健食品和功能食品中银杏叶萜类内酯的质量分析。