复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺优化及其风味成分分析

（广东石油化工学院石油化工清洁生产工程技术开发中心，广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东茂名525000）

龙眼，又称桂圆，为无患子科龙眼属植物。龙眼树为常绿乔木，食用部分是假种皮，乳白或淡白色，肉质脆，清甜[1]。其果肉含有多种营养物质，有补血安神、健脑益智、补养心脾的功效，是健脾长智的传统食物，对失眠、心悸、神经衰弱、记忆力减退、贫血及抗衰老等有益[2-3]。

我国龙眼产业规模化、产品系列化正在形成，传统产品形式为鲜果、龙眼干及龙眼肉干[4]，深加工产品如龙眼果汁[5]、龙眼果酒[6]和龙眼果醋[7]等也有研究开发。龙眼果酒和龙眼果醋属于发酵食品，近年来龙眼果酒的研究更为常见，例如，龙眼酒菌种筛选[8]、工艺优化[9-10]及风味分析[11]均有报道。龙眼果醋是在龙眼果酒的基础上进行醋酸发酵后制得，目前对龙眼果醋发酵工艺的研究相对较少，且缺乏对龙眼果醋风味分析的研究[12-14]。

针对目前龙眼果醋工艺研究较少，风味分析缺乏的现状，本研究以龙眼和柠檬复合果汁为主原料，接种活性干酵母经酒精发酵得到基酒，以基酒为基础，单因素及正交试验优化了复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺，对优化工艺酿造所得复合龙眼果醋进行质量评价，并利用气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析了其风味成分，为更符合当代人们健康理念的龙眼果醋的成功开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与菌株

“储良”品种新鲜龙眼：产自广东省茂名市高州；柠檬：市售；干酵母：湖北安琪酵母有限公司；沪酿1.01醋酸菌：广东石油化工学院食品教研室保藏。

1.1.2 试剂与仪器设备

普通级别白砂糖：市售；氢氧化钠、溴钾酚紫、盐酸、偏重亚硫酸钾、无水乙醇、酚酞、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、亚硫酸钠、氯化钠（均为分析纯）：广州化学试剂厂；蛋白胨、葡萄糖、胆盐、果胶酶（500 U/mg）、乳糖、琼脂：生工生物工程（上海）股份有限公司。

HB-K800型榨汁机：广东半球电器有限公司；DHZ-DA型卧式恒温摇床：常州杰博森仪器有限公司；LX-B35L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：济南博华仪器有限公司；J-HH-6A型精密数显恒温水浴锅：冠森生物科技（上海）有限公司；SPX-250数显生化培养箱：上海昕仪仪器仪表有限公司；V5000型可见光分光光度计：上海元析仪器有限公司；PHS-3C雷磁pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；WZ系列手持折光糖度计：浙江托普云农科技股份有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度计：漳州市新奥光电仪器有限公司；2010QP-Plus型气质联用仪：日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 复合龙眼果醋的工艺及操作要点

复合龙眼果醋的工艺主要包括鲜龙眼果汁制备、鲜柠檬果汁制备、龙眼柠檬复合果汁调配、酒精发酵、醋酸发酵及灭菌过滤等步骤等[15]，具体操作步骤见图1。

图1 复合龙眼果醋的工艺流程Fig.1 Technological process of compound longanfruit vinegar

龙眼汁的制备：鲜龙眼去皮去核取果肉后称重，打浆榨汁后于龙眼汁中按龙眼果肉的重量，添加15 g/100 kg的偏重亚硫酸钾；然后在龙眼汁中添加终浓度为0.2 g/L的果胶酶，45℃放置，酶解2小时后过滤[10]。

龙眼柠檬复合果汁调配：新鲜柠檬去皮去核取果肉打浆榨汁过滤后，不断搅拌下添加于上述处理的龙眼汁中，不间断测其pH值变化，当pH值达到3.5时，完成复合龙眼柠檬汁调配。

酒精发酵得基酒：上述龙眼柠檬复合果汁加白砂糖调配初始糖度为22%，活性干酵母按产品说明书活化后按接种量15%接入，于22℃静置发酵7天后得到复合龙眼果醋酿造基酒[6-11]。

醋酸发酵：将活化后的醋酸菌加入复合龙眼果酒中进行醋酸发酵，置于恒温摇床上进行振荡发酵，7 d左右醋酸菌将乙醇转化为乙酸，乙酸不再变化时，发酵完成，复合龙眼果醋生成[12-14]。本研究中通过单因素及正交试验优化了复合龙眼果醋的醋酸发酵阶段的工艺。

灭菌过滤：采用巴氏消毒法（70℃，5 min）对复合龙眼果醋进行灭菌，澄清后过滤。

1.2.2 复合龙眼果醋醋酸发酵阶段的单因素试验

以总酸含量为指标，分别考察发酵温度、基酒初始酒度、醋酸菌接种量及摇床转速等因素对醋酸发酵的影响，试验于250 mL的锥形瓶中进行，装载量均为50 mL，每个试验处理设置3个重复，其具体条件设置如下：

发酵温度：基酒初始酒度10%，醋酸菌接种量10%，摇床转速为180 r/min，发酵温度设定为27、30、33、36、39℃，发酵7天后测定总酸含量，总酸（以乙酸计）采用酸碱滴定法测定。

基酒的初始酒度：发酵温度33℃，醋酸菌接种量10%，摇床转速为180 r/min，基酒的初始酒度设定为6%、8%、10%、12%、14%（体积比），发酵7天后测定总酸含量。

醋酸菌接种量：发酵温度33℃，基酒初始酒度10%，摇床转速为180 r/min，醋酸菌接种量设定为6%、8%、10%、12%和14%，发酵7天后测定总酸含量。

摇床转速：发酵温度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接种量10%，摇床转速设定为120、140、160、180 r/min和200 r/min，发酵7天后测定总酸含量。

1.2.3 正交试验法优化复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺

由以上的单因素试验结果，选取发酵温度（30、33、36℃）、基酒初始酒度（8%、10%、12%）、醋酸菌接种量（8%、10%、12%），进行三因素三水平的正交试验优化复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺，试验于250 mL的锥形瓶中进行，装载量均为50 mL，试验重复3次，发酵7天后测定总酸含量，取其平均值作为优化指标。

1.2.4 复合龙眼果醋的质量指标评价

根据GB2719-2003《食醋卫生标准》，对复合龙眼果醋的感官、理化及微生物指标进行评价[16]。

1.2.5 GC-MS分析复合龙眼果醋的风味成分

萃取条件[17]：准确量取5 mL果醋，移入10 mL钳口样品瓶中，加入2.00 g NaCl，聚四氟乙烯隔垫密封，在磁力搅拌器上加热至60℃，平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头顶空吸附 40 min，插入GC进样口解析5 min，进行GC-MS分析。

GC 条件[11]：DB-WAX 色谱柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm），进样口温度为240℃，载气为He，流速为1.83 mL/min，检测器温度为35℃。柱温采用程序升温方式：35℃保持3 min，以10℃/min升至115℃，保持3 min，然后以5℃/min升至235℃，保持10 min。

MS条件[11]：EI电子轰击源，离子源温度200℃，电离电压70 eV，接口温度250℃，扫描范围45 m/z～450 m/z。

定性定量分析[18-19]：检索质谱自带的NIST2.0和Wiley谱库，再结合有关文献进行人工谱图解析，确认各种香气成分。采用峰面积归一化法计算出各组分的相对含量。

1.2.6 数据处理

应用SPSS12.0统计软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 复合龙眼果醋醋酸发酵单因素试验结果

各因素对复合龙眼果醋醋酸发酵阶段的影响如图2所示。

温度对复合龙眼果醋的醋酸发酵影响显著，30℃～36℃内总酸含量较高（图2A），因此，选取 30、33、36℃这3个温度水平进行醋酸发酵正交试验。从图2B可以看出在8%～14%的基酒初始酒度范围内，复合龙眼果醋的总酸差异显著，在8%～12%间复合龙眼果醋的总酸含量较高，因此，选取8%、10%、12%这3个基酒初始酒度水平进行醋酸发酵正交试验。图2C中可以看出，在8%～14%内的醋酸菌接种量对复合龙眼果醋的醋酸发酵影响显著，8%～12%的接种量范围内复合龙眼果醋的总酸含量较高，因而，选取8%、10%、12%这3个醋酸菌接种量水平进行醋酸发酵正交试验。图2D表明，在不同的转速条件下，总酸含量的变化不显著，因此，不选取发酵转速作为正交试验的因素。

图2 各因素对复合龙眼果醋醋酸发酵阶段的影响Fig.2 Effect of single factor on acetic acid fermentation for compound longan fruit vinegar

2.2 正交试验法优化复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺的结果分析

正交试验法优化复合龙眼果醋的醋酸发酵工艺的结果如表1所示。

表1 复合龙眼果醋醋酸发酵L9（33）正交试验结果Table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

续表1 复合龙眼果醋醋酸发酵L9（33）正交试验结果Continue table 1 Orthogonal experiment results of acetic acid fermentation for compound longanfruit vinegar

由表1可知，发酵温度、基酒初始酒度和醋酸菌接种量这3个因素所对应的极差（R）大小顺序为：B＞C＞A，从而得知影响复合龙眼果醋醋酸发酵的主次因素依次为基酒初始酒度、醋酸菌接种量、发酵温度。

而k1、k2、k3分别为各因素各水平所对应的总酸含量的平均值，由表1可知，在 A 因素中，k2＞k1＞k3；在 B因素中，k2＞k3＞k1；在 C 因素中，k3＞k2＞k1。因此，各因素水平对结果影响的强弱顺序是：A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，由此可得出复合龙眼果醋的酿造工艺的最优方案为A2B2C3。

综合分析，最终确定复合龙眼果醋的酿造工艺的最佳组合方案是A2B2C3，即发酵温度为33℃、基酒的初始酒度10%、醋酸菌接种量12%。在此条件，3次重复验证试验结果为，复合龙眼果醋的总酸含量为（6.80±0.06）g/100 mL。

2.3 复合龙眼果醋的质量评价

2.3.1 复合龙眼果醋的感官指标

复合龙眼果醋感官指标的评价结果见表2。

表2 复合龙眼果醋的感官评价表Table 2 Sensory evaluation of compound longan fruit vinegar

结果表明，以龙眼和柠檬为原料采用最佳醋酸发酵工艺酿制而成的复合龙眼果醋产品色泽金黄亮丽，酸味柔和，口感上佳，体态透明清澈无沉淀，具有特有的果香和醋香。该复合龙眼果醋感官指标符合GB 18187-2000《酿造食醋》。

2.3.2 龙眼柠檬汁、复合龙眼果酒、复合龙眼果醋理化成分指标比较

对复合龙眼果醋中总酸含量、总糖、还原糖进行测定，得出复合龙眼果醋的理化指标，结果见表3。

表3 龙眼柠檬汁、复合龙眼果酒、复合龙眼果醋的理化成分指标Table 3 Physicochemical indexes of longan-lemon juice，fruit wine and compound fruit vinegar

通过这3种物质的对比，复合龙眼果醋的总酸符合国家标准，相对于其他的两样物质，果醋的总酸含量是最高的，总糖与还原糖的含量相较于复合龙眼果酒也略高，因此，复合龙眼果醋的营养价值更高，更符合人们健康理念。

2.3.3 复合龙眼果醋的微生物指标

复合龙眼果醋微生物指标的评价结果见表4，表明复合龙眼果醋微生物指标均符合GB2719-2003。

表4 复合龙眼果醋的微生物指标Table 4 Microbial indicators of compound longan fruit vinegar

2.4 复合龙眼果醋风味成分的GC-MS结果分析

复合龙眼果醋中各组分质谱经计算机谱库检索及结合文献资料分析，鉴定出21种风味物质，按照出峰时间顺序列出，见表5。

表5 复合龙眼果醋风味物质GC-MS分析结果Table 5 GC-MS analysis results of flavor substances of compound longan vinegar

经统计，复合龙眼果醋的风味成分由醇类物质（8种）、烃类物质（4种）、酯类物质（4种）、酸类物质（3种）及醛酮类物质（2种）组成。其中醇类物质的相对含量最高，为72.82%；其余依次为，烃类物质9.08%，酯类物质8.56%，醛酮类物质6.81%，酸类物质2.71%。

复合龙眼果醋的风味物质中，相对含量较多的均为醇类，其相对含量及呈香分析如下：4-萜烯醇（18.35%）呈胡椒香味，alpha-松油醇（15.38%）呈熏衣草香味，3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇（13.42%）呈沉香味，（-）-4-萜品醇（9.2%）呈丁香味及香茅醇（8.27%）呈玫瑰香味等。

4种酯类物质相对含量均大于1%，其中：（Z）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（橙花乙酸酯）相对含量最高（4.26%），呈橙花和玫瑰香气及蜂蜜和覆盆子甜香味；其次为反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（乙酸香叶酯），相对含量1.91%，有玫瑰和熏衣草香气；甲酸异戊酯相对含量1.31%，有特殊香味；乙酸苯乙酯（1.08%）呈玫瑰花香，带蜂蜜样香气，类似苹果样的果香，并带有可可和威士忌样的香韵。

上述醇类物质和酯类物质是复合龙眼果醋风味的主要成分，是醋体芬芳飘香的保证[20]；另外其他的烃类、醛酮类、酸类物质也是复合龙眼果醋风味的重要组成部分，使得复合龙眼果醋酸味爽快、柔和，是果醋香气不可缺少的重要物质。上述多种香气成分比例协调适宜，造就了复合龙眼果醋饱满的香气和独特的风味。

3 结论

复合龙眼果醋的最佳醋酸发酵工艺条件为发酵温度33℃，基酒初始酒度10%，醋酸菌接种量12%，该工艺发酵所得复合龙眼果醋总酸可达6.80 g/100 mL。所制得复合龙眼果醋的感官、理化和微生物指标均符合国家标准，具有独特风味。复合龙眼果醋的主要风味物质为醇类（4-萜烯醇、alpha-松油醇、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、（-）-4-萜品醇及香茅醇）、酯类（橙花乙酸酯、乙酸香叶酯、甲酸异戊酯及乙酸苯乙酯）等。相对于龙眼果实的风味成分烯烃类[21]，龙眼果酒的主要风味物质醇类（2，3-丁二醇、苯乙醇）及酯类（乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯及 1，4-丁内酯）[11]，复合龙眼果醋的主要风味物质有显著差异，表现出其独特风味。