黄芩茎叶黄酮提取物对血管痴呆性大鼠Tau蛋白表达的影响

曹岩菁 吴佳丽⋆ 李鹏 冯莉 王琴 任谦

血管性痴呆（VD）［1］是多种脑血管因素导致，主要以记忆、认知功能损害，同时伴有语言、运动、人格等多方面障碍的综合征。目前，关于血管性痴呆的治疗仍是亟需解决的难题。多年来，国内外研究人员发现，中药黄芩茎叶黄酮（SSTF）不仅能对老年性记忆缺陷有明显的改善作用［2］，且对血管性记忆障碍的改善也有同效，然而其具体作用机制尚不明确。2015年6月至2016年1月作者通过实验研究，探讨不同剂量SSTF对VD大鼠模型的行为学及其对p-tau、PP2A、GSK3β蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂和材料 SD 大鼠（清洁级）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；0.9%氯化钠注射液（浙江莎普爱思药业股份有限公司）；注射用青霉素钠（江西省科达动物药业有限公司）；碘伏（德州欣瑞达消毒制品有限公司）。SSTF提取物购自河北承德医学院药理研究室（Lot No. 010608）。药物纯度≥62%。

1.2 实验动物及分组 SD大鼠60只（19month，平均230～270g，雌、雄各半）。排除有游泳障碍的大鼠。随机将大鼠分成正常组、假手术组及模型组（SSTF-50：术后8d予50mg/kg的SSTF喂养至68d。SSTF-100：术后8d给予100mg/kg SSTF喂养至68d）。BCCAO法造模。假手术组步骤同上，仅分离双侧颈总动脉不阻断血流，术后8d给予0.9%生理盐水至68d［10ml/（kg·d）腹腔注射］。正常组不做任何处理，给予0.9%生理盐水至 68d［10ml/（kg·d）］。去除死亡大鼠。

1.3 Morris水迷宫实验 采取Morris水迷宫实验对大鼠进行行为和认知功能测试。记录正常组、模型组及药物干预组四组在术后63～68d Morris 迷宫实验的结果。通过软件追踪记录分析，评价大鼠的记忆能力及脑缺血损伤模型对记忆的印象等。痴呆标准：对照组大鼠模型逃避时间的均值为参考值，计算实验各组大鼠各时段平均逃避潜伏期与参考值之间差值占该大鼠的平均逃避潜伏期的比值，如＞20%定为模型成功。

1.4 Western blotting检测 术后12周，选取每组9只进行断头取脑，4%甲醛固定，行免疫组化检测。将大鼠断头取脑，冰上分离大脑皮层和海马，液氮速冻，于-80℃保存，行Western blotting检测。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（），用t检验。水迷宫实验中逃避潜伏期及游行距离间的差异使用two-way ANOVA分析和post-hoc检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组VD大鼠认知功能障碍比较 见图1。

图1 各组大鼠认知功能障碍

2.2 各组大鼠tau蛋白磷酸化的水平比较 见图2。

图2 各组大鼠tau蛋白磷酸化水平比较

2.3 SSTF对GSK3β蛋白表达活性的影响 见图3。

2.4 各组大鼠Cdk5、p35、p25蛋白的表达比较 见图4。

2.5 各组大鼠PP2A蛋白表达比较 见图5。

图3 各组大鼠GSK3βSer9蛋白的表达比较

图4 各组大鼠Cdk5、p35、p25蛋白表达比较

图5 各组大鼠PP2A蛋白表达比较

3 讨论

本研究以BCCAO动物模型为基础，观察了动脉栓塞后大鼠脑组织广泛慢性缺血状态下的动物行为学的特点。结果显示，在水迷宫试验的训练阶段，随着训练次数的增加，与正常对照组大鼠相比，痴呆组大鼠的逃避潜伏期明显延长；探索试验中，痴呆组大鼠穿越平台的次数明显减少。同样，与正常组比较，痴呆组大鼠在象限中游行距离的百分比也明显缩短。表明在慢性缺血60d后，大鼠表现为明显的学习及空间能力的障碍。给予SSTF提取物100mg/kg干预治疗后，能够明显缩短痴呆组大鼠逃避潜伏期的时间，增加大鼠穿越平台的次数，延长大鼠在象限中游行的距离，最终达到改善大鼠认知功能障碍的目的，表明100mg/kg是SSTF提取物能够产生效用的最小剂量。

本资料显示，随着缺血时间的不断延长，磷酸化的tau蛋白在大鼠额叶皮层及海马中表达明显增加。而当给予100mg/kg的SSTF干预治疗后，痴呆组大鼠脑额叶皮层及海马磷酸化tau蛋白的水平明显下降。以往研究表明，Tau蛋白过度磷酸化是痴呆及记忆障碍发生的主要病理机制之一，过度磷酸化的tau蛋白有助于Aβ和神经纤维缠结的形成［3］，而后者又加重了缺血性卒中后的神经损伤和细胞凋亡。鉴于磷酸化tau蛋白与疾病的进展关系密切，SSTF是否能够通过降低tau蛋白的过度磷酸化水平，而改善痴呆大鼠的认知功能障碍的机制还需进一步深入研究。

众所周知，一些酶的家族，尤其是激酶，在tau蛋白磷酸化过程中扮演重要角色。虽然，GSK3β（S199、T231、S396、S413） 和 Cdk5（S202、T205、S235、S404）具有相似的磷酸化激活位点［4］，然而二者的作用机制却有较大的区别。Cdk5蛋白的基础活性较低，需要激活物才能激活，除此之外，Cdk5位于胞浆内，而其生理激活物P35蛋白却是膜相关蛋白。只有在P35钙蛋白酶水解生成P25释放至胞浆时，才能进一步激活Cdk5蛋白［5］。这提示GSK3β与Cdk5对tau蛋白磷酸化的作用机制不同。本资料显示，当给予100mg/kg的SSTF干预治疗后，GSK3β和Cdk5蛋白的表达在正常组，假手术组及药物干预组四者间无明显差异，表明SSTF黄酮提取物不能影响痴呆大鼠脑GSK3β和Cdk5蛋白的表达。然而，对于磷酸化的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β），其水平在血管痴呆性大鼠脑额叶皮层及海马中表达明显下降，表明在慢性缺血致脑损伤后，GSK3β在缺血大鼠大脑皮层及海马内的表达呈动态变化，下降的p-GSK3β可能参与慢性全脑缺血状态下的大鼠认知功能障碍的发生。进一步，SSTF提取物100mg/kg干预治疗后，血管痴呆组大鼠大脑皮层和海马内p-GSK3蛋白的表达明显增高。而p35的表达，本资料结果表明，痴呆组大鼠脑皮层及海马内的p35蛋白表达明显增高，p25蛋白在血管性痴呆大鼠脑内表达明显增高，100mg/kgSSTF提取物后，能够明显降低p35，p25蛋白的表达水平。表明SSTF提取物参与了对GSK3β和Cdk5蛋白活性的调节，从而导致了tau蛋白在不同位点的磷酸化水平的降低。

PP2A是一种广泛存在于真核细胞内的，丝氨酸／苏氨酸磷酸酯酶中极为重要的一种蛋白磷酸酯酶，在细胞功能的诸多方面均起着相当重要的作用，直接或间接参与了细胞的新陈代谢、信号转导、DNA复制、蛋白合成、生长发育及凋亡等活动方式。本资料显示，慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠的脑皮层及海马中，PP2A-sub B蛋白的表达明显下降，表明PP2A参与了缺血状态下的大鼠认知功能障碍的发生。而这些变化似乎均与tau蛋白有关，tau蛋白是PP2A作用的底物，当PP2A活性降低时能够抑制tau蛋白的去磷酸化，而tau蛋白在过度磷酸化后会形成NFT，进一步影响大脑的认知功能［6］。进一步分析发现tau蛋白过度磷酸化可能与GSK3β，PP2A的表达失衡有关。而给予一定浓度和剂量的SSTF后，显著改善GSK3β和PP2A间的平衡，从而降低缺血大鼠大脑皮层及海马内磷酸化tau蛋白的水平，继而改善大鼠的记忆功能。