老龄大鼠听功能下降与线粒体DNA4834bp缺失突变的关系

黄海林 刘俊⋆

老年性耳聋是老年人中发生率较高的慢性疾病，是衰老在听觉器官的表现。研究表明，衰老与线粒体功能紊乱密切相关，而线粒体功能紊乱是线粒体DNA突变引起的。Bai等［1］报道mtDNA4977缺失与老年性耳聋存在可能相关性。Fischel-Ghodsian等［2］检测5例老年性耳聋患者膜迷路和螺旋神经节中mtDNA编码的细胞色素氧化酶Ⅱ基因，发现老年性耳聋患者mtDNA突变率高于老年对照组，但突变发生的部位和数量均存在较大个体差异。常见的线粒体DNA缺失突变片段有 13162bp，10422bp，7663bp，7436bp，4989bp，4977bp，其中人mtDNA4977bp（对应大鼠4834bp）是mtDNA中最为常见突变类型［3］。2015年10月至2016年3月作者通过实验研究，探讨老年性聋发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠20只，其中24个月龄SD大鼠10只，平均（647.83±10.35）g；3个月龄SD大鼠10只，平均（210.78±5.62）g，所有动物均无噪声暴露史及其它药物使用史，且无中耳炎，动物由华中科技大学同济医学院提供。

1.2 方法 （1）分组：20只SD大鼠经听性脑干反应（ABR）检测，排除中耳炎后按年龄分2组，各10只，24个月龄为观察组；3个月龄为对照组。（2）检测大鼠听性脑干反应（ABR）反应阈：分别对对照组和观察组大鼠进行ABR反应阈测定（测定方法参照孔维佳建立方法［4］）。测试前两组大鼠用10%水合氯醛按照0.4ml/kg腹腔内注射麻醉，使用GSI Audera脑干诱发电位仪测试。（3）蜗神经核及内耳组织mtDNA提取：两组动物ABR测试结束后立即麻醉断头处死，首先提取脑蜗神经核：于中线处剪开颅骨，将脑组织轻轻从颅骨中取出，根据蜗神经核［5］定位提取脑蜗神经核，置入匀浆器中，加入2ml匀浆液（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.1mmol/L，0.01mol/L蔗糖）匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作）。匀浆液4℃离心1000g l0min，取上清液0℃离心12000g 15min，弃上清液，沉淀物即为脑组织蜗神经核线粒体。然后提取内耳组织：提取双侧听泡，置于4℃预冷的充氧无钙镁细胞外液中（0.1mol/L PBS，pH 7.4），体视显微镜下剥去骨性蜗壳，解剖出耳蜗Corti器，血管纹，螺旋神经节等内耳组织。蜗神经核和内耳组织线粒体DNA提取方法：各组织置入匀浆管，加入RIPA裂解液，再加入蛋白酶 K，至终浓度10mg/ml，摇匀混合，55℃水浴过夜消化。最后用酚-氯仿-异戊醇抽提取线粒体DNA，所得 DNA 溶于 50μl TE 溶液，-20℃保存备用。取2μl DNA样本溶液稀释至50μl，用紫外线核酸检测仪器检测A260/A280纯度值并测定其浓度大小。（4）线粒体DNA缺失检测分析：根据大鼠线粒体基因组全序列（Genbank序列号X 14848），并遵循引物设计原则，引物由上海生工生物工程公司合成：P1：5'-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3'，P2：5'-AGT GAG ATA AGG AAG CCT GC-3'，引物合成后用灭菌超纯水稀释成10μmol/L 的工作液，-20℃冻存。配制25μl PCR反应体系：Taq DNA 聚合酶（2.5U）0.5μl，引物（10μM） 各 1μl，dNTPs 2μl，PCR buffer2.5μl。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，反应35个循环；末次72℃延伸7min。引物P1、P2如可以扩增597bp片段，则提示样本中有mtDNA4834bp缺失。如样本中无4834bp缺失突变，应在现实反应条件下无法合成近5000bp片段，故无法扩增出597bp PCR产物。（5）PCR产物鉴定与分析：各组PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，电泳缓冲液1 X TAE，电压100V，用凝胶成像仪扫描成像并保存结果。在紫外灯下确定597bp目的基因条带位置，将凝胶与产物一起切出，用DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN APGX-50G）分离纯化。加样后将离心管置37℃水浴1h，酶切产物经2. 5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶成像仪扫描成像并保存结果。

1.5 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR反应阈 对照组大鼠ABR平均听阈（19.50±3.69）dB， 观 察 组 大 鼠 ABR平 均 听 阈（46.00±3.94）dB，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 mtDNA4834bp缺失突变电泳结果 对照组大鼠脑组织蜗神经核样本（10例）及内耳组织样本（10只）均未检测出597bp（提示4834bp缺失）扩增条带（见图1），观察组大鼠蜗神经核样本检出率为100%；内耳组织样本检出率90.0%。见图2。

图1 对照组各组织标本PCR结果

图2-1 观察组蜗神经核组织mtDNA PCR结果

图2-2 观察组内耳组织mtDNA PCR结果

2.3 PCR酶切电泳 根据大鼠线粒体基因组全序列（Genbank序列号X 14848），根据DNASTAR软件选择限制性内切酶（HphⅠ）酶切，酶切位点见图3，结果证实酶切产物来自mtDNA4834bp特异型缺失扩增片段，见图4。

图3 HphⅠ限制性内切酶酶切位点

图4 PCR产物酶切电泳图

3 讨论

老年性耳聋发生机制目前尚不明确，大多学者认为其由多种危险因子的长期累积共同作用形成，其中最主要因素为衰老。根据Harman［6］提出衰老的自由基学说，认为衰老是由自由基引起的组织随机毒害的结果，自由基损害作用的机制主要涉及DNA的损伤，尤其是mtDNA的氧化损伤，其持续产生于线粒体电子传递链的活性氧簇（ROS）是衰老过程中线粒体DNA氧化损伤产生的主要原因。由于mtDNA裸露于产生高氧自由基的线粒体内膜下，本身无组蛋白的保护又缺乏损伤修复系统，其突变率较核DNA高10～20倍［7］，极易受氧自由基的侵袭发生氧化修饰和mtDNA突变，由缺陷的mtDNA编码的呼吸酶影响电子转运功能，增加电子泄露，不断产生的ROS又反过来继续氧化损害线粒体功能，导致不同组织细胞程度不一的mtDNA累积突变的蓄积，即“老化的线粒体理论［8］”。衰老过程中产生的mtDNA缺失突变型mtDNA比完整的野生型mtDNA长度小［9］，复制速度快，其增殖优势导致缺失突变型mtDNA分子比例随年龄增长不断累积增加。当细胞内突变mtDNA积累达到氧化磷酸化（OXPHOS）所生成的能量低于维持正常细胞功能阈值时，组织器官开始退化，出现临床症状，引起老年退化性疾病，在听觉器官表现为听力逐渐下降。本实验中对照组大鼠ABR平均听阈为（19.50±3.69）dB peSPL，观察组大鼠ABR平均听阈（46.00±3.94）dB peSPL，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

老年性聋是机体衰老过程在听觉器官的表现。研究发现线粒体DNA突变与老年性耳聋的发生关系密切。人类mt DNA 在8483～13459bp之间存在着13bp的重复序列，在氧化应激刺激下，易发生断裂，在修复时由于两端重复序列，产生DNA两条链下游环，该碱基环富含鸟嘌呤碱基，对自由基及其敏感，一旦受到ROS攻击，该环降解即容易导致“误认”发生了4977bp片段缺失［10］，此机制被称为线粒体重组滑行错配学说。此缺失在大鼠，mtDNA8103-12937bp之间存在16bp直接重复序列，故大鼠也存在类似缺失突变（mtDNA4834bp）的常见缺失（CD）。突变不仅存在衰老组织中（心肌、肝、脑、肺、肾等），还可存在于线粒体脑肌病、进行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre综合征等疾病中，且随着年龄增加在组织中逐渐积累［11］。本实验PCR扩增出597bp片段（提示mtDNA4834bp缺失），该缺失突变编码包括ND3，ND4，NDS，COIII，ATPaseB，ATPase6 等［12］基 因，影响呼吸链有关亚单位蛋白的合成，从而形成有缺陷的呼吸链，ATP产生不足导致蜗内离子失平衡，内环境紊乱，最终导致内耳毛细胞非特异性损害，引起听力下降［13］。本实验在大鼠蜗神经核和内耳组织中均发现了mt4834bp缺失，表明该常见缺失普遍存在于衰老组织。因此以后可以通过减少和预防mtDNA缺失突变的发生，以缓解和预防老年性耳聋发生发展，从而为治疗老年性耳聋提供新突破。但老年性聋不一定均有mtDNA4834bp片段缺失，本实验中观察组有1只未检测到该缺失突变，表明除了基因背景以外，还有其他环境易感因素（如药物，噪音等）在老年性聋的发病过程中起重要作用，具体机制有待于进一步的研究。