HTR4介导Hippo信号通路在糖尿病心肌病性心力衰竭中的作用及莫沙比利干预效果研究

张治平 倪松 林笋美

糖尿病是由胰岛素分泌不足或功能异常而导致的一组以持续性高血糖为病理特征的代谢性疾病，常累及心血管系统，诱发糖尿病性心肌病，是独立于心脏自主神经病变之外的心脏结构和功能异常［1］。少数患者可能发生糖尿病心肌病性心力衰竭（DCM-HF），发病程度重，病死率高［2］。寻找兼有改善心肌功能和降血糖效果的药物是降低DCM-HF发生率，改善DCMHF治疗效果的重要方向，在此导向下，5-羟色胺受体4（HTR4）受到越来越多的重视［3］。作为HTR4激动剂，莫沙比利可能同时具有心肌保护和降糖功能，2016年1月至12月作者通过实验研究，建立DCM-HF大鼠模型，观察莫沙比利作用的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物为100只SPF级雄性SD大鼠，7～8个月龄，体重（180±20）g，购自浙江中医药大学实验动物中心。

1.2 实验药品 枸橼酸莫沙比利片，生产企业：江苏豪森药业股份有限公司，国药准字：H19990315。

1.3 主要仪器与试剂 生物显微镜（日本Olympus，CX23）；小 动 物 超 声 仪（ 加 拿 大 Visual Sonics，VEVO）；智能型高效离心机（德国Beckman Coulter，Avanti JXN-30/26）；血糖仪（瑞士ROCHE，ACCUCHEK）；小型垂直电泳和电转印装置（美国BIORAD，Mini- PROTEAN3）；链脲佐菌素（Sigma官网，S0130）；DAB 显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，DA1010）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，P0009）；多克隆兔抗HTR4抗体（ab60359）、多克隆兔抗LATS2抗体（ab110780）、单克隆兔抗YAP1抗体（ab52771）、山羊抗兔IgG抗体（ab150077）均购自Abcam官网。

1.4 模型制备与评价方法 模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组均采用高脂饮食和腹腔注射链脲佐菌素的方法制备DCM-HF模型，主要步骤：予以高脂饮食，配方：50%普通饲料+28%猪油+2%蛋黄+20%糖，饲养期间每隔4周尾静脉取血测定糖耐量和胰岛素耐量，产生胰岛素抵抗者予以链脲佐菌素，多数大鼠产生胰岛素抵抗时间为8～12周。腹腔注射链脲佐菌素，用量35mg/kg，注射后继续高脂饮食饲养，每隔1周尾静脉取血测定血糖，连续2次测定值≥11.1mmol/L为糖尿病模型制备成功。所有成功的糖尿病模型继续高脂饮食饲养8周，高剂量组、中剂量组和低剂量组分别予以莫沙比利4mg/kg、2mg/kg、1mg/mg，溶于无菌蒸馏水，灌胃给药。8周后采用超声心动图测定大鼠心功能，主要指标：左室舒张末期容积（LVEDV）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室收缩末期内径（LVESD）。左室射血分数（LVEF）=（LVEDV- LVESV）/LVEDV×100%；左 室 缩 短 分 数（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。LVEF和LVFS均较正常值下降＞30%为DCM-HF模型成功。

1.5 心肌组织病理观察方法 各组随机选取6只，进行多聚甲醛心脏灌注，灌注的目的在于排出循环系统血液，并固定心脏组织，灌注至全身僵硬时，可取完整心脏组织，制备石蜡病理切片，厚度3～5μm。二甲苯脱蜡，连续2次，梯度酒精脱水，45%、60%、75%、85%、95%、无水乙醇分别浸泡5min。苏木素染色，盐酸酒精分化，伊红复染，再次经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，生物显微镜下观察心肌组织病理形态。

1.6 心肌组织蛋白表达水平测定方法 各组剩余大鼠不行心脏灌注，直接断头处死，取心肌病理组织，液氮保存，用于免疫蛋白印记（WB）实验。主要步骤：采用蛋白质抽提试剂盒提取心肌组织的蛋白质，并溶解于Buffer液，备用。BCA法测定样品蛋白质浓度，以10μg/电泳通道的上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将不同分子量的蛋白条带分开，并常规电转印至NC膜。5%的脱脂牛奶封闭1h，封闭的作用在于消除非特异性蛋白结合条带对实验结果的影响。一抗孵育，HTR4、LATS2、YAP1抗体浓度分别为1∶1500、1∶2000和1∶1500，4℃过夜；二抗孵育，三种蛋白的二抗一致，浓度均为1∶2000，37℃孵育90min。ECL显影和暗室显像后保留胶片，Image J软件分析灰度值，目的产物蛋白表达量=目的条带灰度/内参条带灰度。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。正态分布计量资料以（）表示，三组间比较用方差分析，两组间比较用独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制备结果 本实验无大鼠死亡，模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组模型制备成功率分别为60%（12只）、75%（15只）、65%（13只）、65%（13只），整体成模率为66.3%。

2.2 各组大鼠心肌功能比较 见表1。

表1 各组大鼠心肌功能比较［%，（）］

表1 各组大鼠心肌功能比较［%，（）］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，ΔP＜0.05；与中剂量比较，▲P＜0.05

组别 n LVEF LVFS模型组 12 65.5±7.3* 37.8±5.1 *低剂量组 15 72.4±8.2 *# 44.3±5.5 *#中剂量组 13 79.3±9.2 *#Δ 51.7±6.4 *#Δ高剂量组 13 84.6±9.4 *#Δ▲ 57.2±7.2 *#Δ▲对照组 20 94.3±10.6 71.3±9.1

2.3 各组大鼠心肌组织病理观察 对照组大鼠心肌细胞排列整齐，连接紧密，有明显的肌纤维结构，肌束间分割线明显；模型组细胞核出现溶解，肌丝、肌节、肌纤维结构消失，胞浆内可见较大的增厚性条带；低剂量组、中剂量组和高剂量组的变化介于对照组和模型组之间，病变程度较模型组轻。见图1。

图1 各组大鼠典型心肌组织HE染色

2.4 各组大鼠心肌组织HTR4、LATS2、YAP1表达水平比较 见表2、图2。

表2 各组大鼠心肌组织HTR4、LATS2、YAP1表达水平比较

图2 各组大鼠心肌组织HTR4、LATS2、YAP1的WB实验灰度图

3 讨论

HTR4激动剂莫沙比利能提高II型糖尿病患者的血胰岛素水平和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平，具有降糖作用，被认为是一种潜在的抗II型糖尿病药物。另有研究表明［4］，激活HTR4能够增加胰岛素受体酪氨酸残基磷酸化，提高胰岛素受体的敏感性，缓解糖尿病性胃轻瘫。进一步研究表明［5］，HTR4特异性的分布于肌肉组织，因此高表达于心肌组织、胃肠肌群和骨骼肌。HTR4在心力衰竭的治疗中仍受争议，其拮抗剂和激动剂均可能有治疗心力衰竭的作用。一方面，早期的研究表明5-羟色胺（5-HT）与受体HTR4结合可发挥正性肌力作用，促进心肌的收缩功能；实验动物性研究也证实心肌中HTR4水平在发生充血性心力衰竭时可提高数倍，同时与心肌收缩性呈正比，提示HTR4在心力衰竭心肌中的表达可能是一种保护性机制［6］。另一方面，有研究指出HTR4拮抗剂能显著提高心脏左室舒张功能，改善左室射血分数，但对其他指标却无改善［7］。产生这些争议的原因可能与疾病类型和药物使用时间有关，DCM-HF的病理结构不同于充血性心力衰竭，HTR4在DCM-HF中具体发挥什么作用还需要相加详实的数据支持。有学者利用基因芯片技术证实在糖尿病心肌病心肌组织HTR4水平表现出先升高后下降的趋势，伴随着心脏出现收缩功能下降，进而收缩和舒张功能均下降。以上研究提示HTR4及其激动剂可能兼有降血糖作用和改善心力衰竭作用。

Hippo信号通路是一条细胞生长抑制性信号通路，能够控制器官的生长、发育和损伤后修复，对心肌发育与修复、心血管发育与修复均有重要作用［8］。在Hippo信号通路中，LATS是最主要的核心激酶之一，高表达于心肌和骨骼肌组织，其定位与HTR4基本一致。进一步研究表明控制Hippo通路的G蛋白偶联受体（GPCR）能被HTR4激活，表明Hippo通路可能参与HTR4对心血管和骨骼肌系统的功能调控［9］。

本资料结果显示，DCM-HF大鼠的心肌功能明显低于健康大鼠，经莫沙比利干预后其心肌功能有明显提高，且提高程度与干预剂量有一定的相关性。同时DCM-HF大鼠的HTR4和LATS2表达水平明显降低，YAP1表达水平升高，经莫沙比利干预后HTR4和LATS2表达水平得以升高，YAP1表达水平得以降低，且其改变幅度与剂量密切相关。LATS2是Hippo通路的核心成员，过表达LATS2的转基因小鼠心脏发育受到阻碍，出现体积减小、重量减轻或功能不全［10］；敲除LATS2的小鼠由于中胚层过度增殖，也会出现心脏发育异常，过度增厚，心室结构不良［11］。YAP1是Hippo通路的主要下游效应蛋白，LATS2能够磷酸化YAP1的127位点，使其无法进入细胞核传递信号，停留在细胞质而失活，因此Hippo通路主要通过抑制YAP1活性而调控其下游生理功能，通过该途径，Hippo通路对Wnt、胰岛素样生长因子（IGF）信号等均可达到调控作用［12］。敲除YAP1与过表达LATS2可发挥相仿的作用，表现为小鼠胚胎发育障碍，器官发育不全而死亡。在小鼠出生以后诱导心肌细胞过表达YAP1还可以增加心肌细胞数量和心脏总重量。可见，Hippo通路对心脏有双重作用，激活Hippo通路对心脏修复是否有利取决于疾病的具体病理变化。本研究结果显示HTR4激动剂莫沙比利对DCM-HF大鼠的心肌功能具有改善作用，且该作用与激活Hippo通路有关。