MTB分泌蛋白抗原85B-早期分泌靶抗原6融合蛋白对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

安晓颖 杨永辉 朱桂云 方鹏 白洪忠 章志华

结核性胸膜炎目前常用的检测方法主要包括胸膜活检、胸腔积液检测、胸部CT扫描等[1-3]，但其检查阳性率低、培养周期长且活检创伤性较大，容易导致漏诊及误诊。近年来结核性胸膜炎发病过程、发病机制的研究越来越深入，以γ-干扰素(IFN-γ)为主的辅助性T细胞1(Th1)型免疫应答在结核性胸膜炎的发病机制中起重要作用，一些基于细胞免疫反应的检测方法为结核性胸膜炎的诊断开辟了新的途径[4-5]。

细胞免疫是机体抗结核感染的主要途径，结核分枝杆菌分泌蛋白可诱导细胞免疫应答，其中分泌蛋白抗原85B(Ag85B)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)是MTB生长过程中的主要分泌蛋白，具有高度的保护性免疫能力[6-8]。它可激活CD4+T 淋巴细胞(简称“CD4+细胞”)，并促使Th1增殖，诱导产生IFN-γ，促进抗体产生和增强巨噬细胞吞噬消化MTB的能力。因此，笔者采用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白对不同组别患者胸腔积液和外周血细胞成分进行刺激，通过流式细胞检测上述融合蛋白刺激后T淋巴细胞分泌抗原特异性IFN-γ的水平，以评价此种方法在结核性胸膜炎中的诊断价值。

资料和方法

一、资料

1．研究对象：所选患者均为2014年1月至2015年1月河北省胸科医院住院患者。本次研究入选结核性胸膜炎患者45例，男31例，女14例，年龄20～45岁，平均(35.13±6.77)岁；非结核性胸膜炎患者26例，男14例，女12例，年龄20～45岁，平均(33.46±7.56)岁。健康体检者25名，体检各项指标均在正常范围内，其中男14名，女11名，年龄20～45岁，平均(33.96±7.81)岁。研究对象性别、年龄差异均无统计学意义(表1)。

2．纳入标准：(1)所有研究对象均无心、肝、肾等脏器并发症及其他感染，无糖尿病、自身免疫相关性或免疫性疾病，3个月内无重大手术及外伤史，未用过免疫抑制剂及糖皮质激素等药物，未行胸膜腔内药物治疗；(2)结核性胸膜炎患者诊断标准参照《临床诊疗指南·结核病分册》[9]，符合以下条件：①胸膜活检提示抗酸染色阳性的肉芽肿性病变；②胸腔积液或胸膜活检涂片及结核分枝杆菌培养阳性，或TB-DNA检测阳性；③胸膜活检提示肉芽肿性病变，抗酸染色涂片阴性，但临床及影像学检查支持结核，且抗结核药物治疗有效；(3)非结核性胸膜炎患者纳入标准，临床诊断不是由结核分枝杆菌感染所引发的类肺炎性胸腔积液和恶性胸腔积液患者；(4)健康人群均为至我院体检中心进行常规体检者，符合纳入标准(1)且无纳入标准(2)和纳入标准(3)情况的体检人员。所有研究对象在采集标本前均告知并征得本人同意并签署知情同意书。研究方案取得本院伦理委员会批准。

表1 不同组别研究对象的性别和年龄比较

注a：结核组与非结核组比较；b：非结核性组与健康组比较；c：结核组与健康组比较

二、方法

1．标准品准备：IFN-γ标准品为冻干粉(购自北京旷博生物技术有限公司)，使用前2000×g离心10 s，加入250 μl 稀释缓冲液，混匀冰浴5 min，取一支八连排管，标记1～8，每管加入120 μl 稀释缓冲液，取60 μl标准品原液加入1号管，混匀，由1号管依次转移60 μl到下一管混匀至7号管，8号管为本底，完成梯度稀释(3倍稀释)。

2．标本采集及处理：所有研究对象，使用肝素和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管分别采集外周血4～6 ml；结核性胸膜炎患者和非结核性胸膜炎患者接受规范的胸腔穿刺抽液术，收集新鲜胸腔积液50 ml，2 h内送检；结核性胸膜炎患者和非结核性胸膜炎患者的活检组织标本经手术或细针穿刺获得，使用4%甲醛固定24 h，常规病理取材、包埋、制片。

3．外周血和胸腔积液中IFN-γ水平测定：收集的外周血和胸腔积液在30 min内，1000×g离心10 min，取上清，根据Aimplex®Human custom 5-plex kit(货号T1C052806，购自北京旷博生物技术有限公司)说明书，使用流式细胞仪[型号NovoCyte D1040，购自艾森生物(杭州)有限公司]测定IFN-γ的含量。

4． MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血和胸腔积液细胞产生IFN-γ水平的测定：使用淋巴细胞密度分离液，分离外周血和胸腔积液中单个核细胞(PBMCs)。将得到的细胞使用MD-AIM-V细胞培养基进行重悬，计数板计数，稀释至2×105个细胞/ml，取200 μl于96孔细胞培养板，并加入MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白(Ag85B-ESAT6融合蛋白终浓度为1 mg/L)[10]。将培养板置于37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养，孵育16～18 h 后收集细胞培养液上清，采用流式细胞仪，根据Aimplex®Human custom 5-plex kit说明书，测定IFN-γ水平。

5．免疫组织化学染色(IHC染色)检测：活检组织标本石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复和内源过氧化物酶清除等步骤后，流水冲洗干净待用；除去切片上的水分，在离活检病灶组织3 mm处用IHC油笔(PEN-0002，迈新)画圈，加CD4(ab133616，abcam)和CD8(ab85792，abcam)一抗室温孵育1 h，PBS冲洗3次；加二抗孵育30 min，PBS冲洗3次；DAB显色5 min，蒸馏水冲洗3次，苏木精染色，吹干封片，镜下观察拍照，采用Image-Pro plus软件检测，以积累光密度值(IOD值)均值表示并进行统计学分析。

三、统计学处理

结 果

一、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清和胸腔积液中IFN-γ水平比较

在未使用MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，结核组与非结核组血清中IFN-γ的含量比较，差异无统计学意义(t=1.747，P=0.085)；结核组与健康组比较，差异无统计学意义(t=1.412，P=0.163)；非结核组与健康组血清中IFN-γ的含量比较，差异无统计学意义(t=-0.317，P=0.752)(表2)。

在MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前，非结核组患者胸腔积液中IFN-γ含量为(47.99±11.49) pg/ml，结核组患者胸腔积液中IFN-γ含量为(411.91±41.56) pg/ml，结核组患者IFN-γ含量高于非结核性胸膜炎组，两组比较差异有统计学意义(t=55.194，P<0.001)(表3)。

二、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后外周血和胸腔积液中单个核细胞产生IFN-γ水平的比较

结核组、非结核组和健康组研究对象外周血中单个核细胞经过MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白刺激后， IFN-γ含量分别为(401.90±72.54) pg/ml，(40.04±6.80) pg/ml和(39.86±6.97) pg/ml，结核组与非结核组、健康组比较差异均有统计学意义(t值分别为33.211、33.204，P值均<0.05)。非结核组与健康组比较，差异无统计学意义(t=0.094，P=0.925)(表4)。

表2 不同组别MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前血清中IFN-γ含量比较

注a：结核组与非结核组比较；b：非结核性组与健康组比较；c：结核组与健康组比较

表3 结核与非结核组胸腔积液行MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后的IFN-γ含量比较

注刺激前结核组与非结核组比较(t=55.194，P=0.000)，刺激后结核组与非结核组比较(t=51.478，P=0.000)，刺激后结核性胸膜组与刺激前非结核组比较(t=51.499，P=0.000)

表4 不同组别MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血中单个核细胞产生IFN-γ含量比较

注a：结核组与非结核组比较；b：非结核组与健康组比较；c：结核组与健康组比较

结核组和非结核组患者胸腔积液中单个核细胞经过MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后，结核组患者的IFN-γ含量为(1342.67±167.96) pg/ml，非结核组患者的IFN-γ含量为(48.76±11.25) pg/ml，两组比较差异有统计学意义(t=51.478，P=0.000)(表3)。

三、MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血和胸腔积液中IFN-γ水平的比较

结核组外周血中单个核细胞经MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后与刺激前血清中IFN-γ的含量比较，差异有统计学意义(t=32.879，P<0.001)。非结核组和健康组患者外周血刺激前后IFN-γ的含量比较，差异均无统计学意义(t值分别为0.554、0.122，P值均>0.05)(表5)。

结核组患者胸腔积液中单个核细胞经MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后较刺激前胸腔积液中IFN-γ含量升高，两者比较差异有统计学意义(t=36.085，P=0.000)。结核组患者胸腔积液刺激后较非结核组患者刺激前IFN-γ的含量比较，差异具有统计学意义(t=51.499，P<0.001)。非结核组患者胸腔积液刺激前后比较，差异无统计学意义(t=0.244，P=0.808)(表3)。

四、IHC染色检测结果

采用IHC染色的方法检测结核与非结核组患者组织标本中CD4+和CD8+细胞的分布情况(图1～4)，检测结果显示，结核性胸膜炎患者组织标本中CD4+和CD8+细胞的IOD值分别为(16 349.91±2376.36)和(10 525.77±1164.86)，非结核组患者组织标本中CD4+和CD8+细胞的IOD值分别为(1853.64±670.40)和(1327.15±175.55)；结核组患者的CD4+和CD8+细胞量与非结核组比较显著增高，差异有统计学意义(t值分别为14.381、19.127，P值均为0.000)。

表5 不同组别MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后外周血中IFN-γ含量的比较

图1 非结核组CD4+细胞染色(IHC染色 × 4) 图2 结核组CD4+细胞染色(IHC染色 × 20) 图3 非结核组CD8+细胞染色(IHC染色 × 4) 图4 结核组患者CD8+细胞染色(IHC染色 × 20)

讨 论

结核性胸膜炎是胸腔积液的常见原因，发生于胸膜腔局部。主要临床表现为胸膜充血、血管通透性改变、中性粒细胞浸润，随着病情进展胸膜表面有纤维素性渗出，继而出现浆液渗出。传统的检测方法包括胸膜活检、胸腔积液检验、胸部 CT扫描等，由于创伤性大或检测阳性率低等因素为结核性胸膜炎的诊断及治疗带来挑战。随着免疫学检测技术的进展，一些基于细胞免疫反应的检测方法已经用于临床检测[11]。

结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ作为抗结核感染免疫反应的关键性细胞因子，通过体外测定其表达水平能够有效判定机体结核分枝杆菌感染情况。目前，对于胸腔积液γ干扰素释放试验(IGRA)的临床应用研究比较广泛，Ates等[12]发现胸腔积液标本采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) 技术检测结核性胸膜炎的准确性较差。笔者采用流式细胞仪检测结核性胸膜炎患者和非结核胸膜炎患者外周血和胸腔积液标本中IFN-γ的含量及健康人外周血中IFN-γ的含量，结果显示，结核组、非结核组及健康组血清中IFN-γ的含量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，但结核性胸膜炎患者组胸腔积液中IFN-γ的含量要显著高于非结核性胸膜炎患者组(P<0.05)，与Liu等[13]的研究结果一致，表明胸腔积液IGRA检测特异度高于外周血。同时免疫组织化学染色显示，结核组病灶组织中CD4+和CD8+细胞的表达要显著高于非结核组，表明CD4+细胞在结核病的免疫保护机制中发挥着重要的作用，而且这些免疫细胞还可刺激 CD8+细胞产生免疫反应并促进体液免疫反应的发生[14-15]。

结核分枝杆菌强免疫原性Ag85复合物抗原是结核分枝杆菌中早期的主要分泌性蛋白质，含量十分丰富，其中，Ag85B不但参与分枝菌酸的合成，影响细菌细胞壁的最终装配，参与补体受体介导的结核分枝杆菌吞噬作用，对结核分枝杆菌在宿主体内的行为有重要影响[16]。ESAT6由RD1(region of difference 1)基因区域编码，是结核分枝杆菌在感染早期的分泌性蛋白质，具有免疫保护力。该抗原可被感染了结核分枝杆菌的动物或患者有免疫活性的T淋巴细胞所识别，并产生高水平的IFN-γ；同时也具有刺激B淋巴细胞反应的抗原决定簇[17]。何宗林和杜先智[18]研究显示，Ag85B-ESAT6融合蛋白可诱导长期抗结核免疫记忆，并产生强烈的免疫应答。笔者采用Ag85B-ESAT6融合蛋白[19-20]对不同患者来源的胸腔积液及外周血样本中分离的细胞成分进行刺激，显示结核组刺激前后外周血和胸腔积液中IFN-γ含量差异有统计学意义(P<0.05)，而非结核组和健康组在刺激前后的IFN-γ含量差异均无统计学意义(P值均>0.05)，提示结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血中单个核细胞经Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能诱导产生高水平的IFN-γ，该方法对结核性胸膜炎的辅助诊断有很高的价值[21]。

综上所述，Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激后能显著提高结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ的含量，对于结核性胸膜炎的辅助诊断有较高的临床应用价值。