低级别胚胎囊胚培养及临床结局研究

冯清，罗艳霞

（1.赣州市人民医院生殖医学科，江西 赣州 341000；2.南昌市洪都中医院消化内科，江西 南昌 330008）

体外受精-胚胎移植是一种提高临床妊娠率的医疗技术，随着医学技术的发展，当前临床具有各种各样的控制性超排卵方案，受此影响，任何一个患者都可以于一个促排周期中得到数量足够的高质量卵子[1]。而体外受精-胚胎移植技术则能提高早期胚胎质量，从而对临床妊娠结局带来直接的影响。而在这项技术中，仅有30%的胚胎被成功利用，其余则被浪费[2]。事实上，还有许多低级别胚胎具有较高的发育潜能，经过培养、移植、冻融等一系列操作，这些低级别胚胎也可以得到充分利用。本文选择1 312个体外受精-胚胎移植治疗周期中受精后第三天移植、冷冻后所剩下的6 052枚低级别胚胎，试探究低级别胚胎囊胚具有的发育潜能以及移植新鲜囊胚、冻融囊胚的临床结局，判定低级别胚胎囊胚的培养和移植价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 择取2015年9月～2016年9月期间于妇幼保健中心接受体外受精-胚胎移植治疗123个周期的1 312例患者，所有患者均对本研究知情同意并签署相关协议。将受精后第3天进行移植与冷冻的6 052枚低级别胚胎继续进行培养直至达到D5/D6。上述女性患者的年龄在23～25岁之间，不孕年限为2～5年，内膜准备方案相同，比较差异均无统计学意义，具有可比性。若患者在第3天胚囊移植妊娠失败，则要将冷冻囊胚解冻并进行移植。

1.2 方法 首先，对精液进行处理。以手淫法从男性方面取得精液，给予液化处理并以密度梯度离心法收集精液，调节精子浓度为每毫升150万个，并以加精法进行授精。以透明质酸酶将胚胎移植患者卵母细胞中的颗粒细胞去除，放入四孔皿中，使用显微镜辅助受精。在取卵后的4～6 h内选择MⅡ期卵子作显微注射，并针对原核期胚胎、第2天胚胎以及第3天胚胎的发育状况进行评分。受精后三日，选择胚胎进行冷冻、移植以及培养操作，探究胚囊形成状况。胚胎培养过程中所使用的额液体均放入含有6%二氧化碳、温度为37℃，湿度环境为100%的二氧化碳培养箱中平衡过夜[3]。

随后，进行胚胎移植与妊娠判断。将解冻的囊胚或卵裂胚转移到美国库克公司生产的移植导管中，经B超引导，将囊胚或卵裂胚移植到患者的子宫中。移植2周后检测患者的血人绒毛膜促性腺激素水平，移植5周后借助超声对妊娠囊与心血管波动进行检查，以判定是否临床妊娠。

之后，对卵裂期与囊胚期的胚胎进行评分。其中，卵裂期胚胎的评分标准为：Ⅰ级：卵裂球有着均匀的大小，或是大小有轻度不均，其碎片少于5%；Ⅱ期：卵裂球有着均匀的大小，或是大小有轻度不均，其碎片少于20%；Ⅲ级：无核碎片在胚胎量中占比超过20%但不足50%；Ⅳ级：无核碎片在胚胎量中占比超过50%[4]。低级别胚胎指的是4、5与超过9个卵裂球Ⅱ级、Ⅲ级以及Ⅳ级，6～10个卵裂球Ⅲ级和Ⅳ级[5]。而胚囊评分标准则为：1期早期胚囊，其胚囊腔不足1/2，2期胚囊：胚囊腔占据了胚囊体积的1/2以上；3期扩张囊胚：胚囊腔与胚胎总体积完全相等；4期胚囊：胚囊腔充满胚胎且胚胎总体积明显变大；5期囊胚：胚囊正在孵出，且滋养外胚层还经过透明带向外凸；6期囊胚：孵出的囊胚从透明带完全孵出。行内细胞团评分，A为细胞多且包裹紧密，B为细胞量较少且结构松散，C为细胞量极少；而滋养外胚层的评分为：A为细胞量多且形成了紧密结合的上皮，B为少量细胞形成的具有松散结构的上皮，C为细胞量极少[6]。

最后，对胚胎进行冷冻保存与解冻处理。按照冷冻液与解冻液的操作说明书严格操作，冷冻与解冻囊胚。移植当日进行解冻的胚胎，需要培养4 h，再根据胚胎评分进行优选，才能进行移植。

1.3 观察指标 探究低级别胚胎囊胚具有的发育潜能以及移植新鲜囊胚、冻融囊胚的临床结局，判定低级别胚胎囊胚的培养和移植价值。

1.4 统计学方法 纳入到实验研究中的患者其所有临床数据均以统计学软件SPSS 21.0进行分析。其中计数资料均以[n（%）]表示，比较采用χ2检验。计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养情况 本文共收集到1 312个体外受精-胚胎移植治疗周期的6 052枚低评分胚胎，对其进行培养，经过2～3 d的体外培养，共有2 122枚形成胚胎，胚胎率达到35.06%。

2.2 临床结局 在新鲜周期的胚胎移植患者中，有囊胚形成的患者为477个周期，而无囊胚形成的患者则为198个周期，其中有胚囊形成的患者其种植率为46.85%，临床妊娠率为52.62%，无胚囊形成的患者其种植率为29.55%，临床妊娠率为35.86%；冻融囊胚患者的临床妊娠率为56.27%，二者进行对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。而在流产率上，有胚囊形成的患者其流产率为7.13%，而无胚囊形成的患者其流产率为9.09%，二者进行对比，差异无统计学意义，见表1。

表1 临床结局[n（%）]

2.3 冻融的卵裂胚与冻融的囊胚的移植结果 冻融囊胚患者的种植率为39.75%，临床妊娠率为56.27%%，而卵裂胚解冻后移植胚胎患者的种植率为25.57%，临床妊娠率为38.91%，二者进行对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。而在流产率上，冻融囊胚患者的流产率为6.46%，而卵裂胚解冻后移植胚胎患者的流产率为10.04%，二者进行对比，差异无统计学意义，见表2。

表2 冻融囊胚、冻融卵裂胚的移植结果对比[n（%）]

2.4 不同级别胚囊的移植结果 优质胚囊的移植周期为163期，解冻胚胎数量为492枚，胚胎种植率为49.59%，临床妊娠率为57.06%，流产率为4.29%；而低评分胚囊的移植周期为187期，解冻胚胎数量为562枚，胚胎种植率为43.06%，临床妊娠率为51.34%，流产率为7.49%。二者对比，差异无统计学意义，见表3。

表3 不同级别胚囊的移植结果[n（%）]

3 讨论

我国目前在进行胚胎发育潜能的判断时通常根据胚胎进行形态学判断，将优质胚胎移植或以冷冻方式保存，将低等级胚胎丢弃，或令其慢慢退化[7]。而随着体外培养技术的不断发展，培养液也在不断地改良，医学工作者在近些年来发现低等级的胚胎经过继续培养实际上也可以发育为囊胚，这意味着胚胎利用率会大大提高，临床妊娠率也会不断增长。而胚胎发育潜力的发掘与筛选则关系到临床妊娠率的提高，即使是低等级胚胎也可以通过胚囊移植来实现着床机会的提高[8]。而从本文研究结果可知，低等级胚胎的胚胎形成率可达到35.06%，在新鲜周期的胚胎移植患者中，有胚囊形成的患者其种植率、临床妊娠率均显著高于无胚囊形成的患者，冻融囊胚患者的种植率与临床妊娠率也显著高于裂胚解冻后移植胚胎患者（P＜0.05），而低评分胚囊患者的种植率、临床妊娠率及流产率与优质胚囊患者相近，这意味着行囊胚培养有助于筛选出具有高发于潜能的低级别胚胎胚囊，而移植冻融囊胚可以提高临床妊娠率。

胚胎利用率一直是我国不孕不育领域治疗方面的不足之处，本文选择低级别胚胎胚囊进行了培养、冷冻移植、冻融操作，经过一系列的研究可以发现，低等级胚胎囊胚经过冻融和移植依然具有很高的发育潜能，因此，具有良好妊娠结局的低级别胚胎胚囊可以为患者所使用。