妊娠糖尿病大鼠胎盘、子宫和心脏组织中Nrf2蛋白表达和氧化应激水平分析

孙聪聪，郑加永，汪文寰，胡艳君，郑建琼，张红萍

（1.温州市人民医院 温州市妇幼保健院 妇产科，浙江 温州 325000；2.温州市妇产科学重点实验室，浙江 温州 325000）

Nrf2（nuclear factor elytroid-derived factor 2-related factor）是细胞氧化应激反应中的关键因子，调节细胞防御反应。在应激情况下，Nrf2与Keap1解离转移至细胞核中，与核内的抗氧化反应元件相结合，启动下游的细胞保护性分子的表达，以维持内环境的稳定。妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期间首次发现或发生不同程度的葡萄糖不耐受，是妊娠中晚期常见的一种并发症，且已被明确规定为糖尿病的独立特殊型[1-2]。而临床糖尿病患者出现的氧化应激、胰岛素抵抗等临床症状与Nrf2的表达存在密切关系[3]，ECHOUFFO-TCHEUGUI等[4]指出，II型糖尿病患者患心脏疾病的风险较大，即II型糖尿病对不同组织的影响可能存在差异。所以，GDM为糖尿病的独立特殊型，对母体不同的组织的影响也可能不同。我们通过构建GDM大鼠模型，检测大鼠胎盘、子宫和心脏组织中胰岛素水平、氧化应激水平[包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA）]及Nrf2蛋白的表达水平，为揭示GDM可能的发病机制及对子代产生的影响提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级雌性和雄性SD大鼠20只，体质量200～250 g，购自温州医科大学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（浙）2016-0287。所有雌雄大鼠均置于通风良好，相对湿度40%～70%，温度为22～25 ℃的屏蔽系统内，自由饮食。给予灯光照明12 h/d，并及时更换饲料。适应性饲养1周后，禁食禁水12 h，快速葡萄糖氧化酶法测尾静脉血糖，称体质量。剔除空腹血糖≥11.1 mmol/L者。将雌雄大鼠按1∶2的比例合笼过夜，次晨发现阴道黏液或镜检有精子者记为妊娠0 d，标记孕鼠，计算孕期。

1.1.2 主要试剂：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于美国Sigma公司；柠檬酸钠购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MDA、大鼠胰岛素水平、大鼠GSH和大鼠SOD等检测试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司，Nrf2抗体和β-actin抗体购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 建立GDM大鼠模型：利用随机数字表，将20只SD孕鼠随机分为2组，每组10只。正常妊娠组：正常饮食。GDM组：禁食12 h，现配45 mg/kg STZ[5-6]，腹腔注射，4 h后正常饮食。腹腔注射STZ第5天后，尾部取血测空腹血糖，空腹血糖高于11.1 mmol/L确定为造模成功的糖尿病模型。正常妊娠组给予等量的枸橼酸缓冲液做阴性对照。STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的枸橼酸钠缓冲液中（现配现用，冰浴保存），按45 mg/kg浓度给予大鼠腹腔注射，每周1次。

1.2.2 提取胎盘、子宫和心脏组织蛋白：对未分娩的孕20 d大鼠禁食12 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉并处死，剖腹取出胎盘、子宫和心脏组织。一份：将组织进行超声处理，2 000 r/min离心15 min，取上清用于胰岛素水平、MDA、GSH和SOD检测。另一份：按照50 mg组织/500 μL裂解液的比例冰浴匀浆组织，裂解60 min后超声处理溶液10 s，裂解液于4 ℃、12 000 r/min离心20 min。吸取上清，测定Nrf2的蛋白水平。

1.2.3 测定胰岛素、MDA、GSH和SOD水平：按照各试剂盒说明书，采用ELISA检测各组大鼠的胎盘、子宫和心脏组织中的胰岛素、MDA、GSH和SOD水平。

1.2.4 Western blot法测定Nrf2蛋白表达：通过BCA法检测蛋白浓度，定量蛋白浓度后，取20 μg溶解在6×loading Buffer中，加入1% SDS定容至20 μL，95 ℃煮沸5 min。蛋白上样20 μL，9%的分离胶，5%浓缩胶电泳。湿法转印蛋白至PVDF膜上。根据分子量大小裁膜，分别加β-actin和Nrf2一抗（稀释浓度分别为1∶2 000）孵育，4 ℃过夜。加羊抗兔二抗（稀释浓度为1∶3 000）孵育，常温2 h。凝胶成像仪扫描结果后进行灰度分析。

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad prism 6.0软件对数据进行统计分析。计量资料呈正态分布，数据以表示，2组间各指标比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的胰岛素水平比较 GDM组大鼠胎盘和子宫中的胰岛素表达水平明显高于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05），而2组大鼠心脏中的胰岛素水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.2 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的MDA水平比较 与正常妊娠组比，GDM组大鼠的胎盘和子宫中MDA水平都有明显的上调，差异均有统计学意义（P＜0.05），而在心脏组织中，其MDA水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图1 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的胰岛素水平比较

2.3 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的GSH和SOD水平比较 与正常妊娠组，GDM组大鼠的胎盘和子宫中GSH和SOD水平都有明显的下调，差异均有统计学意义（P＜0.05），而在心脏组织中，其GSH和SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

2.4 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中Nrf2蛋白表达水平的比较 与正常妊娠组比，GDM组大鼠胎盘和子宫中Nrf2蛋白表达水平上调，差异均有统计学意义（P＜0.05），而心脏中Nrf2蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

3 讨论

图2 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的MDA水平比较

图3 2组大鼠胎盘、子宫和心脏中的GSH和SOD水平比较

图4 2组大鼠中胎盘、子宫和心脏中Nrf2蛋白表达水平的比较

GDM的发病率仍在逐年上升，对母婴的危害大，但迄今为止，其发病机制尚不清楚，严重限制了该病的早期诊断、病情的监控和预后的判断。GDM患者体内大多存在胰岛素抵抗、脂类糖类氧化等代谢异常[2，7]。因此，我们对GDM患病机体的不同组织中氧化应激和胰岛素水平进行了深入探讨。

氧化应激是指机体在受到有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生过多，超出了ROS和RNS的清除能力，导致氧化还原系统失衡，从而引起细胞内脂质、蛋白质和核酸的氧化性损伤，最终引发细胞凋亡和组织器官损伤。为维持机体的氧化还原平衡，当自由基过多时，机体会自发产生防御反应以清除ROS和RNS。本研究结果显示，GDM导致胎盘和子宫中的氧化水平明显提高，且自由基的清除能力明显减弱，与LAPPAS等[8]的研究结果基本一致，且GDM女性体内产生过量氧自由基的同时，氧自由基的清除能力也会减弱。据报道，高糖环境往往会造成氧化损伤，糖尿病长期高糖状态导致胰腺组织中抗氧化酶SOD、CAT活性降低，脂质过氧化产物MDA含量增加，ROS生成增多，氧化应激增强[9]。这为后续深入探讨GDM与氧化应激的关系提供了理论基础。

Nrf2属于CNC碱性亮氨酸拉链转录激活因子家族，是调节体内氧化应激进行自我保护的重要转录因子[10]。Nrf2几乎在所有的组织中都表达，影响Nrf2发挥作用的主要为Keapl蛋白质[11]。静息状态下，Nrf2因结合Keap1而被抑制活性；当氧化应激时，Keap1与Nrf2分离，Nrf2信号通路被激活，Nrf2转移到细胞核，与肌腱纤维瘤蛋白结合形成异二聚体，诱导一系列内源性细胞保护基因上调，其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白质、抗炎和解毒的蛋白质，发挥细胞自我保护作用[11-12]。CHENG等[13]的研究显示，在子宫的胚胎内皮细胞中，GDM会上调Nrf2的表达，并减低细胞的抗氧化能力。根据本研究结果，GDM可上调子宫组织中Nrf2的表达水平，推测可能是GDM导致的氧化应激调控了Nrf2的表达。

此外，通过对Nrf2基因敲除鼠和Keap-1基因敲除鼠进行研究发现，Nrf2缺失在体内葡萄糖平衡方面有积极的效应，Nrf2激活可减弱胰岛素信号通路对葡萄糖的摄取[14-15]，这提示Nrf2可能与促进胰岛素抵抗，平衡葡萄糖水平相关。而Nrf2作为核转录因子，进入细胞核后，可调控下游相关基因的转录。因此，GDM产生胰岛素抵抗对Nrf2在转录水平上的调控及Nrf2进入细胞核后对下游的氧化应激相关因子表达水平的影响值得进行更深入的研究。

通过比较在胎盘、子宫和心脏中GDM导致的胰岛素抵抗、抗氧化水平及Nrf2的表达水平，我们发现，GDM可导致胎盘和子宫中胰岛素水平上升和抗氧化水平下降，并诱导Nrf2的表达水平上升，而并未导致心脏中这三个水平的改变，我们由此得出结论，GDM导致的胰岛素抵抗及引发的抗氧化能力下降和Nrf2的表达上升可能存在明显的组织差异性。TANG等[16]也指出，GDM导致血清的血清丝氨酸蛋白酶抑制剂水平上调也存在不同组织不同的表型。由此，也明确了GDM发病机制的特殊性，而GDM对母体不同组织影响的具体分子机制到目前仍没有进行深入的研究。未来，我们将更进一步地研究GDM中胰岛素抵抗、氧化应激和Nrf2表达的关系，并详细阐明GDM于不同组织中产生的影响。