妊娠期大鼠镉暴露与妊娠高血压疾病的关系

王繁，邱海凡，刘奕，陈璐璐，范风云，王宗敏

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.产科；2.病理科）

镉（Cadmium，Cd）是一种普遍存在的重金属环境毒物。随着工业化的进展，更多的人暴露于镉污染下[1]。镉对肾脏、心血管系统等多种器官产生不良影响，生殖系统被认为是镉毒性作用最敏感的靶器官之一。妊娠状态下由于部分微量元素相对缺乏，使肠道对镉的吸收明显增加，而导致孕妇体内镉蓄积较非妊娠时高[2]，而且妊娠期间母体和胎儿因生长迅速和细胞分化而易受环境毒物的影响。镉是否因而可以诱发孕鼠的妊娠高血压疾病未见报道。本研究观察不同浓度镉剂量对孕期大鼠的血压、蛋白尿等妊娠高血压疾病临床症状的影响以及胎盘、肝、肾等脏器病理改变，探讨镉对孕鼠的生殖毒性效应及特点。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物为普通级别SD大鼠，购自华中科技大学同济医学院动物研究所，其中雌鼠10～12周龄，体质量200～240 g；雄鼠12周龄左右，体质量300～350 g。所有的动物实验都遵守国际和国家相关准则，实验动物的使用获得同济医学院实验动物委员会批准。在实验开始前让大鼠适应性饲养1周。实验用氯化镉购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组和不同剂量染镉实验：将确定妊娠的成年雌性SD大鼠随机排序分为3组，对照组[n=6，体质量（204.5±5.9）g]，0.25 mg/kg镉处理组[n=7，体质量（210.0±5.1）g]，0.5 mg/kg镉处理组[n=8，体质量（211.8±11.3）g]。镉处理组从妊娠第4天开始至妊娠第19天，每天上午给予孕鼠腹腔注射2 mL/kg相应浓度的镉。对照组腹腔注射2 mL/kg 0.9%氯化钠溶液。非孕组（n=6）在相同的时间以0.5 mg/kg的剂量腹腔注射镉做对照。整个实验期监测大鼠体质量，最后得到的氯化镉最低剂量与最佳时间诱导大鼠妊娠高血压疾病模型。

1.2.2 血压测量：分别在交配前1周，以及妊娠的第4、第12、第19天上午9～11时，使用softron BP-98A型无创血压计，用尾套法检测各组孕鼠尾动脉的收缩压，并以交配前最稳定的血压值作为每只大鼠的基础血压值。大鼠充分安静后连续测量5次，取平均值。计算并比较各组妊娠第4、第12、第19天与基础血压的差值。非孕大鼠则在相应的测量时间检测收缩压。

1.2.3 24 h尿蛋白量测定：在妊娠期的第3天和第19天，将孕鼠放置于代谢笼中，收集其24 h尿液标本并记录尿量，于室温下2 000 r/min离心15 min，吸取其上清液，测量体积后保存于-80 ℃冰箱待检测。采用BCA蛋白试剂盒检测尿液标本中尿蛋白的浓度，按照BCA蛋白分析试剂盒说明书用A液和B液配制成工作液和标准液，然后用酶标仪在562 nm测量OD值。在Excel表中根据标准曲线计算出孔的待测蛋白浓度，再乘以尿液的量，即为24 h尿蛋白量。计算并比较各组妊娠第3天与第19天尿蛋白的差值。

1.2.4 标本收集：妊娠第20天麻醉大鼠后断头术处死大鼠打开腹腔，计胎仔数，观察肝、肾等脏器有无变化，迅速取出胎儿、胎盘、肾脏和脑组织并称重。每只大鼠随机选取3个胎盘、1个肾脏、肝脏、脑组织固定于10%的甲醛溶液，常规制片染色作组织学检查。另取胎盘在0～4 ℃条件下迅速将组织切成1 mm3大小的组织块，用2.5%的戊二醛固定，再放入用相同缓冲液配制的1%锇酸中，于4 ℃固定2 h。然后常规超薄切片，电镜观察细胞超微结构。并另取胎盘及母鼠血，通过石墨炉原子吸收法测其镉含量。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析。各组数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血和胎盘中镉的浓度 0.5 mg/kg镉处理组的孕鼠胎盘镉的水平[（2.81±0.51）μg/g]明显高于0.25 mg/kg镉处理组[（1.03±0.30）μg/g]，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.5 mg/kg镉处理组孕鼠血中也检测到（30.6±0.2）μg/L浓度的镉。

2.2 孕鼠体质量变化的比较 镉染毒前，即妊娠第1天至第4天，各组孕鼠体质量无明显差别。孕期0.5 mg/kg镉处理组体质量增长最小，在妊娠第20天其体质量值明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1A。

2.3 尾动脉收缩压差值的比较 各组间妊娠前、妊娠第4天大鼠尾动脉收缩压差值差异无统计学意义（P＞0.05）。0.5 mg/kg镉处理组在妊娠第12天收缩压开始升高，在妊娠第12天及第19天时其收缩压升高值明显大于对照组及非孕组（P＜0.05）。在妊娠第19天，0.25 mg/kg镉处理组的孕鼠收缩压升高值和非孕组比，差异无统计学意义（P=0.52）。见图1B。

2.4 24 h尿蛋白含量差值的比较 妊娠第19天，0.5 mg/kg镉处理组出现的妊娠相关性的24 h尿蛋白升高值高于对照组、非孕组和0.25 mg/kg镉处理组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；对照组和0.25 mg/kg镉处理组的24 h尿蛋白升高值与非孕组比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1C。

图1 各组大鼠体质量、收缩压和24 h尿蛋白量比较

2.5 镉诱导的孕鼠胎盘、肾脏、肝脏及脑组织的病理改变

2.5.1 肉眼观察：对照组胎盘一般暗红色，色泽均匀；而0.5 mg/kg镉处理组胎盘大小变化不大，但个别胎盘周缘见褐色相间的钙化带。部分肝脏有少许粘连，颜色苍白，部分大鼠出现轻度腹水。

2.5.2 组织学观察：0.5 mg/kg镉处理组孕鼠胎盘组织见绒毛水肿，间质血管扩张充血，并见凋亡细胞。迷路区血管壁增厚，细胞退行性变，广泛纤维蛋白沉积。蜕膜组织空泡变性和肿胀，少量炎细胞浸润。0.5 mg/kg镉处理组肾小球内皮细胞肿胀和间质肾小动脉管壁增厚，管腔狭窄，部分肾小管管腔可见蛋白管型。亦见炎性细胞浸润。0.5 mg/kg镉处理组肝窦淤血，肝细胞浊肿使肝索变窄，甚至出现局灶性坏死，汇管区少量炎细胞浸润。0.5 mg/kg镉处理组脑神经细胞变性、细胞周和血管周间隙增宽，血管充血及灶区出血。见图2。

2.6 电镜观察染镉后胎盘滋养细胞的超微结构变化 0.5 mg/kg镉处理组孕鼠胎盘滋养细胞胞质内细胞器减少。线粒体肿胀，嵴模糊断裂甚至融合消失，呈空泡状，线粒体膜融合，可见髓样化；粗面内质网广泛扩张，脱颗粒现象明显；微绒毛数量减少，且排列紊乱甚至缺失；染色质聚集成块，核膜模糊。见图3。

3 讨论

近年来随着检测技术的不断进步及研究方法的不断创新，对微量元素及其与妊娠高血压疾病的关系认识不断深入，发现多种微量元素，包括钙、镁、锌、硒的缺乏以及镉、铅的过量与妊娠高血压疾病的发生、发展有关[3]。镉作为一种环境污染物，在人体内蓄积，对肝脏、肾脏和生殖系统均造成危害[4-5]。急慢性镉暴露可直接引发和导致高血压[6]。

图2 0.5 mg/kg镉处理组和对照组孕鼠的胎盘、肾脏、肝脏及脑组织的HE染色结果

图3 0.5 mg/kg镉处理组孕鼠胎盘滋养细胞超微结构变化

关于镉对孕鼠胚胎毒性影响的研究结果报道不一，一般实验研究多采用灌胃染毒或者腹腔注射的染毒方式[7]。本研究采用在妊娠第4～第19天每天腹腔注射不同浓度的氯化镉（0.25、0.5 mg/kg）对SD孕鼠进行染毒。平均每只大鼠每天0.05～0.1 mg，染毒总剂量为4～8 mg/kg。结果发现0.5 mg/kg镉处理组的大鼠于妊娠第10～第13天血压逐渐升高，并出现蛋白尿、胎鼠体质量减轻等。病理检查见胎盘血管充血，管壁增厚，纤维蛋白沉积，迷路区退化等。肾小球毛细血管内皮细胞肿胀，间质小动脉壁增厚等。镉暴露的孕鼠出现典型的妊娠高血压疾病样的临床症状和病理改变。在妊娠高血压疾病发病机制的研究中，动物模型起着重要作用，有子宫胎盘缺血模型、炎症模型、血容量增加模型等[8]。这些模型从不同方面重复出妊娠高血压疾病的特点，而本研究成功地用重金属镉建立了妊娠高血压疾病的动物模型。本研究发现对孕鼠注射0.5 mg/kg镉8 d后即出现血压升高。该剂量对于非孕组大鼠注射14 d后血压相对于给药前呈轻度升高，同样剂量孕鼠平均增加的血压和增加的尿蛋白量和非孕组相比均有显著性差异。故在本研究中不管是血压还是尿蛋白，孕鼠比非孕鼠对镉的毒性体现了更高的敏感性，表明镉对孕鼠有明显的生殖毒性效应。镉导致高血压的机制包括诱导氧化应激、血管收缩、肾小管损伤、水钠潴留和改变儿茶酚胺代谢等，而这些同样是妊娠高血压疾病的发病基础。本课题组进一步研究还发现镉通过多条途径影响妊娠高血压疾病的发展比如干扰胎盘的类固醇激素的分泌；增加胎盘DNA氧化损伤；上调B淋巴细胞中活化诱导的胞嘧啶核苷脱氨酶的表达，促进血管紧张素II1型受体自身抗体产生过多，激活补体造成器官损伤等，引起镉对孕鼠一系列的生殖毒性效应及临床病理表现[9-11]。

妊娠期间随着孕龄的增长镉在胎盘逐渐聚集，孕晚期胎盘里镉的浓度明显大于母血及脐带血里浓度，说明胎盘也是镉毒性的靶器官之一[12]。镉在胎盘中的储存本身并不是一个优势，因为这种金属对胎盘功能有不利影响。镉可能通过干扰胎盘的血流量、内分泌调节、人体所必需物质的转运和代谢来影响胚胎的正常发育并间接影响母体的正常自我调节状态[13]。有研究称Wistar大鼠孕期镉暴露导致胎盘铁和锌的转运中断，这可能会危及胎儿的营养与活力[14]。镉对绒毛外滋养层细胞迁徙的研究结果表明，低浓度（0.5～1 μmol/L）的镉离子虽然不影响滋养层细胞的存活，但能通过激活半胱天冬酶而影响肌动蛋白细胞骨架组织，以抑制配体诱导的滋养层细胞迁移[15]。此外镉可引起活性氧和促炎性细胞因子的过量生成，都有可能导致妊娠高血压疾病及胎儿宫内发育迟缓[16]。镉在胎盘还可能会干扰胰岛素样生长因子轴或下调β胎盘11β-羟类固醇脱氢酶2型的活性，从而抑制胎儿生长[17]。镉对胎盘的影响同时预示着其对子代发育的干扰，应引起足够的重视。

本研究发现孕鼠暴露于0.5 mg/kg镉以后出现24 h尿蛋白明显升高，表明镉对大鼠肾脏的损伤，由病理检查可见损害部位主要包括肾血管及肾小管。短时接触镉对肾脏的损伤是轻微的，而长期接触镉引起的肾脏损害是不可修复的。镉可以经过多重途径进入体内，肝脏是镉的主要蓄积部位之一，染镉组大鼠肝出现肝细胞水肿变性甚至坏死、线粒体肿胀脊模糊等改变[18]。以往的研究报道镉在脑内的分布往往都是较低水平[19]。本研究中染镉组大鼠出现脑充血，脑水肿等病理改变。可能与怀孕时母鼠血管扩张，血脑屏障减弱有关，小剂量连续镉暴露能够透过血脑屏障在雌性大鼠脑内蓄积，引起脑细胞变性等，出现易激惹和相互撕咬等临床表现。

本研究通过注射镉成功诱导妊娠高血压疾病的大鼠模型，说明镉是妊娠高血压疾病发生的重要因素之一。