建立裸鼠FaDu喉咽癌原位种植瘤模型及其CT和病理研究

娄可心， 罗守华， 张园， 顾宁， 刘方舟

头颈部肿瘤是人体常见恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤3%，其中90%为上皮源性鳞状细胞癌，近年来发病率持续上升，发病年龄也趋于年轻化[1-5]。头颈部解剖结构复杂，随着肿瘤发展，常多方向侵犯、累及多个部位及邻近器官。头颈部鳞状细胞癌扩散主要途径是通过区域淋巴结转移，≥80%头颈部恶性肿瘤发生颈部淋巴结转移，这是头颈部肿瘤患者难治、致死的重要原因[6]。建立头颈部肿瘤的动物模型，对进一步研究其发病及转移机制，寻找积极有效的诊断及治疗方案有重要意义。

1968年从1例印度下咽骨肿瘤患者的钻孔活组织切片(人咽鳞癌细胞)中建立了FaDu瘤细胞株。在建立细胞株中发现细胞质含有成束细丝，并且细胞上桥粒特别突出[7]。FaDu是一种较稳定的可移植肿瘤细胞株，与头颈部肿瘤多数低分化鳞癌有病理共性[8]。FaDu可在实验动物体内接种，具有较高的局部淋巴结转移及肺、肝等远处转移特性，在大型动物模型研究上具有较高的应用价值。本研究在裸鼠喉咽部建立FaDu头颈部肿瘤动物模型，观察其CT表现和病理学，研究该动物模型的稳定性及实验价值。

1 材料与方法

1.1 造模动物及材料

无特定病原体远系杂交BALB/c裸鼠30只(购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏2013-0016)，雌雄不限，鼠龄5～6周龄，体质量(18.1+0.5)g，SPF条件下饲养(东南大学医学院动物实验中心)。实验前动物适应新环境5 d。裸鼠单只饲养，保持恒定环境，温度20～25 ℃，湿度60%，每天饮水和进食随意。所有实验均在白天进行。所有实验操作均在30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔静脉麻醉后进行。FaDu瘤细胞株由上海中国科学院细胞库提供。本研究通过南京医科大学动物伦理学委员会批准，实验用动物均符合动物伦理学要求。

1.2 荷瘤裸鼠制备

1.2.1 制备过程 癌细胞接种常规培养FaDu细胞，取对数生长期FaDu细胞，用0.25%胰酶消化，PBS洗细胞2次，1 000 r/min(12 000 rpm 15 cm)离心5 min，收集细胞，用0.9%氯化纳溶液悬浮细胞，定容，细胞以5×106个(0.2 ml/只)接种于裸鼠喉部。裸鼠喉部定位方法：裸鼠麻醉后颈过伸位，标记甲状软骨板位置，用18号穿刺针穿过甲状软骨板，有落空感后退针注射肿瘤细胞悬液，缓慢退出针头，并用无菌纱布块压迫针孔数分钟，以防止瘤细胞渗漏及出血。

1.2.2 裸鼠成瘤情况 自肿瘤种植成功起，每天观察实验鼠的精神状态、饮食、活动等一般生命体征。每2～3天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)及短径(b)，取各组长短径均值，按公式ab2/2计算肿瘤体积。

1.2.3 病理检查 剥取肿瘤块，4%甲醛固定。自固定液中取出标本，流水冲洗30 min；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；浸蜡，包埋。以3 μm厚度连续切片；常规烘片脱蜡(60 ℃、10 min)；二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；HE染色3 min；1.0%盐酸乙醇分化数秒；自来水冲洗5 min；pH 7.5～8.0稀氨水浸泡数秒，自来水冲洗5 min；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。在显微镜下行常规肿瘤组织病理检查。

2 结果

2.1 裸鼠成瘤情况观察

平均15 d，裸鼠喉咽部出现种植瘤，直径0.4～0.5 cm，成瘤率100%(30/30)，并且随时间增加而增大，无自发消退现象，见图1。由于移植瘤生长，实验裸鼠出现张口呼吸，这是由于移植瘤长大堵塞呼吸道所致。所有实验裸鼠到晚期均出现呼吸急促、发绀，最后全身衰竭而死亡。

图1 原位种植瘤模型外观裸鼠原位种植瘤模型，可见肿瘤位于颈部气管前，局部侵犯裸鼠颈前皮下

2.2 病理结果

裸鼠种植瘤HE染色，肿瘤细胞与人喉咽鳞癌相似，生长良好，详见图2。

图2 裸鼠种植瘤病理切片(HE ×200)细胞核大深染，核分裂象多见，可见癌巢

2.3 影像学结果

肿瘤种植成功后第2、3、4、5周行小动物microCT(苏州海斯菲德公司His can VM)扫描，观察肿瘤大小及侵犯部位。CT扫描方法：进行横轴位扫描，扫描层厚为3 mm，采用0.3 mm间隔[9-12]。种植肿瘤表现为等/稍高信号。见图3。

图3 原位种植瘤microCT图像裸鼠microCT图片，裸鼠喉部声门上区显示清楚，肿瘤主要位于喉咽部，向外生长侵及裸鼠颈前皮下

3 讨论

自1969年首次成功将人结肠癌进行裸鼠体内传代种植开始，裸鼠便广泛地用于人类肿瘤的实验研究[13]。至今发现几乎所有人恶性肿瘤均能在裸鼠上种植。种植物通常分为3种：① 肿瘤外科标本直接进行种植；② 通过其他宿主系统建立肿瘤可种植株；③ 体外培养肿瘤细胞系的种植。裸鼠用作肿瘤种植实验方法简单，无需对动物作特殊前处理，并且异种肿瘤种植成功率高。种植传代的肿瘤组织尽可能保留了原有的生物学特性，种植瘤可在裸鼠体内或体表生长，瘤体生长类型基本相同。皮下种植瘤体通常与皮肤及皮下组织无粘连，易于分离，便于观察、测量和进行活体检查，种植瘤原有的形态与生物学特性基本保持不变。肿瘤细胞染色体核型分析表明，传代肿瘤仍保留原肿瘤核型，用其他同工酶及免疫方法分析，发现人类恶性肿瘤种植传代后的瘤体仍保持人类恶性肿瘤的特点。

影响种植成功因素包括：种植部位及接种途径、接种物含量、接种物浓度、肿瘤类型、动物营养状况等。对于本模型来说，应考虑以下影响因素：① 性别，如肝癌、前列腺癌易种植于雄性裸鼠，乳腺癌则在雌性裸鼠体内生长得更好[14]。② 鼠龄，裸鼠鼠龄也是重要因素，一般选择4～6周龄裸鼠进行实验。如鼠龄过大，裸鼠体内产生较多NK细胞，影响肿瘤种植成功率。③ 接种瘤细胞量，接种量过少，种植瘤不易成活；接种量过大，则引起肿瘤失控生长，对以后实验干预带来负面影响。一般认为以5×106个/(0.2 ml/只)为较适宜接种剂量[15]。④ 裸鼠营养状况，裸鼠体重轻，营养状态不佳时肿瘤通常生长较慢，加喂熟鸡蛋黄后营养状况明显改观。本研究用4～6周龄裸鼠进行实验，人喉咽癌细胞株FaDu以5×106个/(0.2 ml/只)接种于裸鼠喉咽部，成功建立人喉咽癌裸鼠种植瘤模型。该模型种植成瘤率达100%(30/30)，肿瘤生长稳定。

鳞状细胞癌是头颈部常见癌症，占所有新确诊癌症病例3%[16]。过去几十年尽管在肿瘤细胞和分子生物学方面开展大量研究，运用最新肿瘤治疗和外科手术，但头颈部鳞状细胞癌患者死亡率和发病率一直居高不下，因此，探索头颈部肿瘤发病机制进行积极的诊疗非常重要。国内外学者对头颈部鳞状细胞癌进行了大量基础及临床研究。以往研究多采用小鼠做为研究对象来诱发肿瘤，但有些学者发现小鼠与人类头颈部鳞状细胞癌在某些特性上有差异。沈毅等[17]通过建立兔舌不同部位VX2鳞癌和颈淋巴结转移模型，对其生物学特性进行研究，发现与人类基本一致，生长迅速、容易转移，是较理想的动物肿瘤模型[18]。本实验鉴于FaDu肿瘤生物学特性与人类鳞状细胞癌具有较高相似性，采用裸鼠做为实验动物，喉咽移植瘤成功率达100%，可能因位置相对表浅，操作方便，注射肿瘤细胞悬液量容易控制，保证植入肿瘤细胞悬液活性所致。

本研究证明通过此种方法可在短期内大批量建立所需喉咽癌动物模型，其稳定性和重复性较好，成瘤率可达100%，根据观察晚期可发生颈淋巴结转移和肺转移，临床症状同人类十分相似，为研究头颈部肿瘤及淋巴结转移提供依据。由于肿瘤种植的部位位于喉咽部，喉咽部移植对周围组织侵犯范围较广，可侵及气管、甲状腺、肌肉等邻近重要器官。实验裸鼠在第4～5周由于肿瘤过大影响呼吸，窒息死亡。同时也要注意注射肿瘤细胞悬液时局部压力过高可导致“注射播散”，另外，肿瘤细胞注射到血管内，出现肺转移和淋巴结转移也应引起注意。