AQP2、γ-ENaC、NHE3在阴虚水肿证大鼠肾脏的表达改变及意义※

徐文峰何泽云唐 群彭亚平彭亚军李旭华陈 涛

（1 湖南中医药大学第一附属医院肾脏内科，湖南 长沙 410000；2 湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410000；3 湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410000）

水肿是肾科常见症状，研究表明水通道蛋白2（AQP2）、γ型上皮钠通道 （γ-ENaC）、Na+/H+交换体3（NHE3）表达异常在水肿发生发展过程中起重要作用。本课题组结合前期工作以阿霉素肾病大鼠为基础，结合连续优甲乐灌胃制备阴虚水肿证模型，观察上述水钠因子表达改变，为后续阐明中医药干预阴虚水肿证提供实验动物模型及数据参考。

1 材料与方法

1.1 动物 50只雄性SPF级146～182 g Wistar大鼠由湖南中医药大学实验动物中心提供 [SYSK（湘） 2013-0005]，饲养于动物中心实验室，每笼5只，普通饲料喂养，自由饮水，隔日更换垫料。

1.2 药物 注射用盐酸多柔比星（阿霉素，深圳万乐药业有限公司，10 mg/支），1支溶解于注射用水5 mL中，每毫升药液含2 mg阿霉素。左旋甲状腺素钠片（优甲乐，德国默克公司，50 μg/片），5片研碎溶解于注射用水5 mL，每毫升药液含50 μg优甲乐。

1.3 动物分组及干预方法 大鼠适应性喂养1周，体质量约200 g后弃去尿蛋白阳性大鼠（尿蛋白试纸检测），随机分为空白组（20只，不做处理）、对照组（5只，尾静脉注射生理盐水）、阿霉素组（25只，尾静脉注射阿霉素），2周后24 h尿蛋白定量≥100 mg提示阿霉素肾病模型复制成功，弃去对照组、造模失败及死亡大鼠（共8只），重新分为空白组（20只，不做处理）、阴虚水肿组（阿霉素模型基础上连续灌服优甲乐悬液，22只），分别于灌胃2周、4周、6周、8周将部分大鼠放入代谢笼，收集24 h尿液，称重后麻醉，腹主动脉取血，剪皮并留取肾脏。

1.4 阿霉素肾病模型制备 75%酒精反复擦拭尾静脉，以6 mg/kg剂量一次性尾静脉注射阿霉素，注射2周后收集24 h尿液，24 h尿蛋白定量≥100 mg提示模型复制成功。

1.5 连续优甲乐悬液灌服 左旋甲状腺素钠片（50 μg/片）5片研碎溶解于注射用水5 mL，每毫升药液含50 μg优甲乐。大鼠称重后以50 μg/100 g剂量连续灌服左甲状腺素钠。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 大鼠一般情况 观察大鼠精神状态、活动度、肛温、体重、尿量、粪便性状、皮肤含水量、背毛色泽等。

1.6.2 生化指标 采用RT-1904C半自动生化仪检测24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、肾功能等，Elisa试剂盒检测大鼠TT3、TT4、TSH。

1.6.3 肾脏病理检查 所有标本经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片（厚为3～5 μm），免疫组织化学法观察AQP2、γ-ENaC、NHE3表达，Motic BA410T显微镜拍照。

1.7 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以 （±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，满足正态性、方差齐性多组比较采用LSD法，不满足正态性、方差齐性多组比较采用Tamhane’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 阿霉素注射3 d后大鼠逐渐出现团缩，活动减少，便溏，饮食饮水减少，烂尾，背毛杂乱，脱毛，2周后大鼠阴囊水肿明显，空白组未出现上述情况，第4周阴虚水肿组大鼠皮肤含水量高于空白组（P＜0.05），提示水肿形成，连续优甲乐灌胃2周后阴虚水肿组大鼠活动频繁，躁动不安，易激惹，饮水量多，鼠笼垫料潮湿，排泄物增多，脱毛，四肢及阴囊水肿明显，肛温高于空白组（P＜0.05），符合“阴虚”表现，灌胃2、4周阴虚水肿组大鼠TT3高于空白组（P＜0.05），灌胃2、4、6、8周阴虚水肿组大鼠TT4高于空白组（P＜0.05），提示阴虚模型复制成功，见表1。

表1 大鼠水肿、阴虚指标比较 （±s）

表1 大鼠水肿、阴虚指标比较 （±s）

注：与空白组比较，★P＜0.05

优甲乐灌胃2周肛温（℃）空白组 66.60±1.14 36.60±0.35 1.13±0.42阴虚水肿组 70.25±1.26★ 37.36±0.30★ 1.97±0.27★组别 尾静脉注射第4周皮肤含水量（%）优甲乐灌胃4周TT3（nmol/L） TT4（nmol/L） TSH（μIU/mL）38.06±10.56 0.71±0.18 151.04±37.98★ 0.79±0.20

第8周阴虚水肿组大鼠体重、24 h尿量、血清白蛋白低于空白组，尿蛋白定量、血肌酐高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。8周内阴虚水肿组大鼠死亡4只。

表2 实验8周后大鼠部分指标比较 （±s）

表2 实验8周后大鼠部分指标比较 （±s）

注：与空白组比较，★P＜0.05

尿蛋白定量(mg/24 h)空白组 579.80±17.05 36.80±12.79 15.86±2.89阴虚水肿组 233.25±29.74★ 17.50±5.45★ 387.73±68.46★组别 体重(g)血肌酐(μmol/L)38.80±3.96 26.80±9.65 19.50±3.70★ 56.75±10.81★24 h尿量(mL)血清白蛋白(g/L)

2.2 各组大鼠肾脏AQP2、γ-ENaC、NHE3免疫组化分析 见图1、表2～5。

图1 灌胃8周免疫组化×400倍

表3 大鼠肾脏AQP2蛋白表达量比较 （±s）

表3 大鼠肾脏AQP2蛋白表达量比较 （±s）

注：与空白组比较，★P＜0.05

组别 灌胃2周 4周 6周空白组 8712.44±1347.83 11574.33±2107.33 10754.27±2147.07阴虚水肿组 29475.37±2345.62★ 25651.61±3642.91★ 23692.53±3854.55★8周11047.39±1975.46 20547.22±2967.49★

表4 大鼠肾脏γ-ENaC蛋白表达量比较 （±s）

表4 大鼠肾脏γ-ENaC蛋白表达量比较 （±s）

注：与空白组相比，★P＜0.05；与灌胃2周相比，②P＜0.05

组别 灌胃2周 4周 6周空白组 9325.21±1452.83 10973.33±2131.33 9685.27±1915.41阴虚水肿组 15462.53±2678.62★ 18950.16±3326.19★② 17972.35±3125.13★8周10317.39±2716.98 16421.22±3367.49★

表5 大鼠肾脏NHE3蛋白表达量比较 （±s）

表5 大鼠肾脏NHE3蛋白表达量比较 （±s）

注：与空白组相比，★P＜0.05；与灌胃2周相比，②P＜0.05

组别 灌胃2周 4周 6周空白组 8325.21±1522.83 10983.33±2011.33 9865.27±2315.41阴虚水肿组 15338.53±2678.62★ 28350.16±4326.19★② 26982.35±4538.23★8周10012.39±2516.98 24523.22±3652.49★

3 讨论

肾病综合征（NS）是肾科常见疾病，水肿是其特征性表现，部分NS水肿患者治疗非常棘手，水肿迁延日久。随着利尿剂、糖皮质激素的使用，临床常有水肿与伤阴并见之象，此阴虚水肿以发汗、利尿、健脾、温肾等法难以奏效，水肿迁延难愈，中医学治疗水肿疗效确切，但目前有关阴虚水肿的理论探讨、机理研究相对较少，本研究参照课题组前期工作，结合优甲乐灌胃制备病证结合的阴虚水肿动物模型，观察肾脏水钠因子（AQP2、γ-ENaC、NHE3） 的表达改变。

水通道蛋白 (AQP)是多种组织细胞膜上的特异性通道，调节水跨膜转运，Wang Y等[1]观察肾活检确诊的54例原发性NS患者，水肿组患者肾组织AQP2阳性面积明显高于无水肿组，尿AQP2亦显著高于无水肿组，提示AQP2参与NS患者水肿的发生发展。太史春等[2]以大鼠腹腔注射卡那霉素制作“肾气虚”模型，2周后发现模型大鼠尿量增加，考虑与AQP2mRNA表达减少进一步导致AQP2生产减少，肾脏集合管重吸收水分减少而产生多尿有关。吴庆昕[3]以大鼠定量化打击法制备血瘀证模型，1周后模型组肾组织AQP2表达、Western blot表达显著升高，体现了中医学“血不利则为水”，同期予丹参干预可使模型大鼠尿量增加，提示丹参活血利尿功效可能与其降低肾小管AQP2水平有关。

上皮钠离子通道蛋白（epithelial sodium channel，ENaC）属于ENaC/Deg超基因家族，主要调控跨上皮细胞的钠离子转运。肾病综合征患者水钠潴留与γ-ENaC异常活化密切相关，尿丝氨酸蛋白酶的分泌有关 (纤溶酶等)可激活γ-ENaC。Bohnert B N等[4]研究发现抑肽酶对上皮钠通道没有直接的抑制作用，但能阻止蛋白水解通道活化。此外，糖皮质激素可激发肾脏集合管Na+的重吸收，增加ENaC活性，导致水钠潴留[5]。李洪岩等[6]以肌注甘油制备急性肾功能衰竭（ARF）模型，发现ARF大鼠尿量先升后降，可能是ARF发生早期以肾小管损伤为主，重吸收障碍因而尿量增加，同时发现γ-ENaC表达增高，与相对正常肾单位代偿性功能增加，增加钠重吸收有关。

Na+/H+交换体（NHE）是存在于所有真核细胞中的一种跨膜糖蛋白，对细胞内外离子的跨膜转运、细胞体积、胞内渗透压的控制、肾脏水钠重吸收和酸碱平衡起重要的调控作用。NHE3是调节肾脏水钠重吸收和酸碱平衡的主要亚型。Eschmann V B等[7]发现PAN肾病大鼠，激活状态的NHE3表达增多，重吸收Na+增多，参与水钠潴留的形成。李洪岩等[8]发现肾脏局部多巴胺主要通过调控NHE3、ENaC发挥利钠利水作用。张文欣等[9]观察100例重症监护室急性肾损伤（AKI）患者，AKI组尿NHE3水平显著升高，升高时间较血清肌酐（Scr）提前24 h，尿NHE3与Scr呈正相关 （r=0.457，P＜0.05）。

本研究以一次性尾静脉注射阿霉素[10]联合连续优甲乐灌胃制备“阴虚水肿”证大鼠模型，尾静脉注射阿霉素2周后大鼠阴囊水肿明显，第4周皮肤含水量高于空白组（P＜0.05），提示水肿形成，连续优甲乐灌胃2周后模型组大鼠活动频繁，躁动不安，易激惹，肛温、TT3、TT4高于空白组（P＜0.05），符合“阴虚”表现。AQP2蛋白表达量第2周最高 （P＜0.05），γ-ENaC、NHE3蛋白量第4周最高 （P＜0.05），提示AQP2、γ-ENaC、NHE3参与“阴虚水肿”证大鼠水肿的发生发展，为进一步阐释中医学治疗“阴虚水肿”提供动物模型及实验数据参考。