对总大肠菌检出率的研究

陈洋

摘 要：总大肠菌群主要来源于人和温血动物的粪便，是评定水被粪便污染的重要指示菌。粪便中除一些正常细菌外，还有许多致病微生物存在，如沙门氏菌、志贺氏菌、肠道病毒等。所以，水样中有粪便污染，可看作对人体健康存在潜在的危害。通过对总大肠菌群数高低的检测，指示了水被粪便污染的程度，同时也反映了对人体健康危害性的大小。

总大肠菌群是人为议定的一个名词，指一群在37℃培养24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。它除埃希氏菌属外，还包括肠杆菌科的柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属等。目前，多采用多管发酵法和滤膜法检测。多管发酵法以最可能数（MPN）表示，适用于生活饮用水及其水源水的测定。滤膜法以（CFU）/100mL）表示，适用于生活饮用水及低浊度的源水测定，本次试验采用多管发酵法。

1、 试验原理

l.1乳糖發酵试验中，大肠菌群能分解乳糖而产生酸，使培养基的pH值降低（指示剂变色）。这一现象可作为观察结果的指示。在酸性环境下，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培养基中产生大量气体而进入导管中，以观察产气情况。

1.2分离培养时，大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红和美蓝结合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时产生金属光泽。该培养基在高压消毒时，忌温度过高和反复加温溶化。因为乳糖在高温下不稳定会分解成葡萄糖和半乳糖，倾注平皿后，在冰箱中4℃下保存不超过14天。

2、试剂及仪器

2.1试剂

2.1.1乳糖蛋白胨培养液

2.1.2伊红美兰培养基

2.1.3结晶紫染色液

2.1.4革兰氏碘液

2.1. 5沙黄复染液

2.1.6乙醇脱色液

2.2仪器

2.2.1培养箱：37±1℃

2.2.2生物实体显微镜 OLYMPUS

2.2.3平皿：直径为9cm

2.2.4试管

2.2.5分度吸管：lml，10ml

2.2.6锥形瓶

2.2.7小倒管

2.2.8载玻片

3、多管发酵法的测定

3.l乳糖发酵试验

取源水一瓶充分摇匀接种l.0、0.1、0.01mL于乳糖蛋白胨培养液中。每个 稀释度接种5管，每个水样接种15管。每递增稀释一次，换用一支1mL灭菌分度吸管，将接种管置于37℃培养箱内，培养24±2h。对产酸产气者按下列步骤进行。

3.2分离培养

将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于37℃培养箱培内，培养18～24h。分别记录下菌落色泽与菌落形态。

3. 3验证试验

对各种色泽和形态的菌落作染色镜检。如为阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置37℃培养箱内，培养24士2h。有产酸产气者，即为总大肠菌群。否则可报告总大肠菌群阴性。

4、菌落色泽与检出率的关系

通过对伊红美蓝平板上不同色泽的菌落进行验证试验，得出菌落色泽与检出率的关系如下：

可见颜色较深的菌落，其检出率大于颜色较浅的菌落。这是因为大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红和美蓝结合成黑色化合物，使菌落呈黑紫色，而不发酵乳糖的细菌则为无色菌落。

5、菌落形态与检出率的关系

观察不同形态的菌落，作验证试验，得出菌落形态与检出率的关系如下：

由上表可以看出，菌落形态光滑、圆润凸起的检出率要大于菌落干燥、扁平的菌落。

6、结果与讨论

通过试验，总大肠菌群检出率高的菌落大致符合下列特征：

菌落形态光滑、圆润、凸起、菌落颜色为深紫黑色，具有金属光泽：紫黑色，不带或略带金属光泽：淡紫红色，中心较深的菌落。

另外，在乳糖发酵试验中，常遇到产气量少或产酸不产气的情况。有时倒管内虽无气体，但在液面和管壁上却可以看到缓缓上浮的气泡。这时可延时培养再观察。一般情况下，产气量与大肠菌群检出率呈正相关。

参考文献：

〔1〕生活饮用水卫生规范2001，198～201

〔2〕水和废水标准检验法第三版472～476

〔3〕张宏陶，《水质分析大全》，科学技术文献出版社，1989

〔4〕中国医学科学院卫生研究所，《地面水水质监测检验方法注解》，1980