骨质疏松症中医类型之间的本质区别及生物学特征

张葆鑫，郝廷，杨晓龙，王兴国

（内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古呼和浩特 010000）

据相关研究显示，疾病的发生多与外界因素和基因因素相关，而线粒体DNA（mtDNA）容易受到自由基的攻击，并导致mtDNA突变，从而形成恶性循环，导致生理机能的衰退[1]。该次实验选取2016年1—12月于该院就诊的骨质疏松症患者共150例，并根据中医辨证类型进行分组，着重了解骨质疏松症与中医证型之间的关联，讨论其相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验选取于该院就诊的骨质疏松症患者共150例，并根据中医辨证类型进行分组，具体而言可分为肝肾阴虚证、脾肾阳虚证和气滞血瘀证，每组50例。与此同时，选择了50名非骨质疏松症的健康人群（气血平和证）作为对照组进行分析。患者年龄在50～63岁之间，且排除了患有继发性骨质疏松的情况，所有患者均为自愿参与实验，在年龄、病程等一般资料对比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

首先，需要对所有患者进行血液标本采集，即在入院后的第二天进行空腹抽血，且抽血前一天晚上10点后禁食，抽血量为8 mL，共2管。其中，一管为干燥管，另一管为含有肝素钠的抗凝管。干燥管样本需要在2 h内进行3 000 r/min离心20 min；肝素管需要摇匀，均放置于-70℃的低温箱中等待检测。在检测方面，需要对mtDNA拷贝数进行相关检测，并根据酶联免疫法对8－羟基脱氧鸟苷酸浓度进行分析，其试剂盒批准号：201301。除此之外，我们将采用PCR对mtDNA的ND3基因和18S基因进行扩增曲线的测量，并计算阈值，其表达式为ΔΔCt=实验组基因 ΔCt－对照组基因 ΔCt[2]。

1.3 观察指标

在实验中将对患者mtDNA拷贝数及8－羟基脱氧鸟苷酸（8－OHdG）的含量进行测定，并对比分析骨密度与mtDNA拷贝数及8－OHdG的相关性。8－OHdG浓度的检测需要采用双抗体夹心法，在HRP酶的作用下，可转变为蓝色，而在酸的作用下可转换为黄色。其颜色可说明8－OHdG浓度的相关性，并计算具体值。除此之外，在mtDNA拷贝数的检测方面将通过ABI 3 900台式高通量DNA合成仪完成具体操作，并结合人线粒体NADH脱氢酶亚单位2以及18sRNA的基因序列进行分析。

1.4 诊断标准

在诊断上，我们将参照骨质疏松症的国际诊断标准，并测量骨密度 （BMD），即t值超过-1.0标准差（SD）则视为正常，t值介于-1.0SD和-2.5SD之间，则为骨量减少；当t值小于-2.5SD时则为骨质疏松症，当患者t值小于-2.5SD并合并骨折症状，则判定为严重的骨质疏松症组。

1.5 统计方法

对上述两组患者各项记录数据进行分类和汇总处理，采取SPSS 19.0统计学软件对上述汇总数据进行分析和处理，计数资料采取百分率表示，计量资料采取均值±标准差（±s）表示，在连续变量的对比上采用 Pearson相关分析法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在mtDNA拷贝数结果上，肝肾阴虚组、脾肾阳虚组均低于气血平和组，但是，气滞血瘀组则表现出最高值，与其他两组患者治疗效果相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 与此同时，在 8－OHdG 的浓度对比上，骨质疏松症组各个中医证型的患者其数值均低于气血平和组，且脾肾阳虚组数值最高，肝肾阴虚组和气滞血瘀组则无明显差异，具体情况如表1所示。

在相关性分析上，mtDNA拷贝数与骨密度呈正相关，而8－OHdG与骨密度则呈负相关性，具体而言，在肝肾阴虚组中，相关系数为0.854，mt DNA拷贝数与骨密度为正相关性，而8－OHdG与骨密度相关系数为-0.862，则为负相关性，其他组别详情见表2。

表1 各组间的mtDNA拷贝数比较情况（±s）

表1 各组间的mtDNA拷贝数比较情况（±s）

组别n2－ΔΔCt ρ8－OHd G/（ng·L-1）ρA，BMD/（g·cm-2）肝肾阴虚组（n=50）脾肾阳虚组（n=50）气滞血瘀组（n=50）气血平和组（n=50）0.851±0.454 0.844±0.846 1.451±0.748 1.208±1.228 196.54±40.32 218.36±47.33 198.35±38.25 178.63±84.69 0.635±0.014 0.702±0.055 0.701±0.048 1.365±0.124

3 讨论

在中医理论中，骨质疏松症属于“骨痿”的范畴，其最为主要的发病机制则是肾虚，并以血瘀作为病理基础，两者相互依存，共同作用引起质变。在找准“肾虚血瘀”的病理机制后，我们对中医证型进行了分别的讨论实验。据相关学者指出，原发性骨质疏松症的病机主要是多瘀和多虚，因此得出了相应的四大类临床证型，分别为：肾阳虚衰、肝肾阴虚、脾肾阳虚、气滞血瘀，结合现代医学手段，进一步发现中医证型间的差异性，寻找实质具有重要意义。

该次实验研究的线粒体基因技术则为中医证型的研究提供了新的方向，这也是对外界环境和基因共同作用的一次理论上的突破，是在内外因素的共同干扰下得出新的结论。线粒体是体细胞的呼吸中心，而mtDNA作为唯一的核外遗传物质，其自身具有结构上的特殊性，属于细胞内核外遗传物质。因此，容易出现损伤并导致突变现象。引起与mtDNA相关因子出现损伤的因素较为多样、复杂，其中，最常见的则为氧化应激，直接会引起蛋白质、DNA的氧化性损伤[4]，并加重患者病情，最终导致急性、慢性损伤。

8－OHdG则属于活性氧族，是导致DNA氧化损伤的产物之一，也是DNA突变的标志。当患者出现缺血、缺氧问题，8－OHdG含量将出现一定程度的上升。而8－OHdG的产生主要依赖于患者体内的活性氧，当活性氧不断增加时，氧化应激过程所产生的ROS将会直接攻击mtDNA，并生成8－OHdG。此时，由于mtDNA自我修复能力较差，且缺乏组蛋白的保护，因此容易导致退行性疾病。在该次实验研究中，骨质疏松症中医证型的三组患者的8－OHdG水平均高于健康组人群，进一步证明了骨质疏松症对患者造成的氧化损伤，且以脾肾阳虚症患者最为突出。相对地，在骨密度的相关性研究结果中，脾肾阳虚证型的患者与8－OHdG的关联最大。

从其他方面来看，线粒体NADH脱氢酶亚单位2基因能够直接参与到呼吸链中，并参加了氢与电子之间的传递，可介入氧化磷酸化而生成ATP。在进一步检测ND2基因的过程中，可以更为准确、直观地反映mtDNA拷贝数。该基因已经成为分析mtDNA损伤线粒体功能障碍的重要指标。据其他研究显示，ND2基因突变与多种疾病相关，包括常见的高血压、糖尿病等，其中最为肯定的疾病为帕金森和阿尔茨海默病。当mtDNA缺失数达到一定的临界值时，则会导致细胞功能障碍，减退，该因素也成为判定衰老的分子生物学标志之一[5]。

综上所述，线粒体DNA相关因子与骨质疏松症中医证型存在一定的相关性，其中脾肾阳虚组与8－OHdG的相关性最高，肝肾阴虚组则与mtDNA拷贝数相关性最高。