慢性鼻-鼻窦炎病人细菌生物膜的表达及分布

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 耳鼻咽喉头颈外科； 2 器官移植中心； 3 手术室)

慢性鼻-鼻窦炎(CRS)是耳鼻喉科常见多发病，严重影响人们的生活质量。研究者们认为CRS并非单一因素导致的疾病，多种因素可能独立或协同参与了其发生发展过程。但临床上仍有部分病人无论采取系统的保守治疗(全身和鼻喷激素、黏液促排剂、抗生素治疗)，还是鼻内镜手术治疗，或是手术结合药物的综合治疗，其临床治疗效果仍不满意。国内外学者研究发现细菌生物膜(BBF)是导致临床治疗CRS效果差的重要影响因素[1-5]。BBF是通过细菌及其自身分泌的胞外多糖类聚合物相互粘连而成的群落，其可黏附于物体表面，生物膜中的细菌对抗生素的耐药性是浮游状态的500～1 000倍[6]，因此，确定鼻腔/鼻窦黏膜是否存在BBF可以为临床治疗CRS提供重要参考。2004年CRYER等[7]首次报道了BBF在CRS病人鼻腔/鼻窦黏膜的存在。

文献报道的CRS病人鼻黏膜BBF检出的阳性率为25%～100%[8-10]。目前国内学者多以扫描电镜来观察BBF，且病例样本数较少。本实验的目的是以激光扫描共聚焦显微镜观察CRS病人鼻腔/鼻窦黏膜表面BBF的形成情况和形态特点，并比较鼻腔不同解剖部位BBF表达的差异，分析BBF与CRS的相关性。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2016年1月—2017年9月在我院住院行鼻内镜手术治疗的病人共67例，其中实验组分为CRS伴鼻息肉(CRSwNP)组共27例，CRS不伴鼻息肉(CRSsNP)组共25例，病人均符合EPOS-2007所提供的CRS伴/不伴鼻息肉的诊断标准。对照组15例病人中，外伤性视神经病病人4例，骨瘤病人3例，单纯上颌窦囊肿病人8例；对照组病人均无鼻窦炎或鼻炎病史以及流涕、鼻涕倒流、鼻塞等相关鼻部症状，体格检查鼻腔黏膜未见异常。所有病人均排除免疫系统疾病及糖尿病、不动纤毛综合征、术前激素治疗史、妊娠及肿瘤病人。所有病人均同意接受手术治疗及将术中所取标本用于本次研究。

1.2 研究方法

3组病人鼻内镜手术时由同一术者取得中鼻甲、钩突及前筛、后筛黏膜。取下黏膜标本后，选取较薄的部分，切除约5～10 mm2大小，置于DMEM高糖培养基中冰袋冷藏，1 h内送至我院中心实验室以生理盐水反复洗涤黏膜标本3次约10 min。后将标本完全置于活/死菌荧光染色剂(BacLight LIVE/DEAD)中，室温暗室放置15～20 min，具体时间视标本的厚薄和大小而定，如果所取标本较厚或较大，染色时间需要延长。再以生理盐水反复洗涤3次约10 min，去除标本表面的染色剂。将洗净的标本置于载玻片上，以防淬灭甘油封片。使用激光扫描共聚焦显微镜(分别设置488和523 nm波长，放大倍数为63倍)观察BBF的形态特点，分析各组间及不同解剖部位生物膜表达的差异性，并对BBF的存在状况与部分临床指标的关系进行分析。

1.3 BBF阳性结果判断

参考国内外文献资料[11]，激光扫描共聚焦显微镜下BBF阳性的判断标准：在5～10 μm大小的鼻腔/鼻窦黏膜细胞周围观察到适当大小及形态呈现绿色荧光的活菌(直径为0.5～2 μm)聚集成微群落，并被云雾状的绿色胞外多糖类物质紧密包绕。

1.4 各指标评分

鼻部症状评分：采用VAS评价方法，鼻部症状最严重为10分，无症状为0分。鼻内镜评分：根据1997年Lund-Kennedy鼻内镜评分标准进行评分；影像学评分：采用Lund-Mackay评分系统对研究对象的鼻窦CT结果进行评分。

2 结 果

2.1 BBF的形态

激光扫描共聚焦显微镜下可见，实验组在5～10 μm大小的鼻窦黏膜细胞周围，有棒状或球形、直径为0.5～2.0 μm、呈现绿色荧光的活菌聚集成微菌落，被云雾状的同样呈现绿色荧光的胞外多糖类物质紧密包绕，见图1。

白色箭头指向BBF。

2.2 实验组与对照组BBF表达结果

CRSwNP组27例病人中有22例黏膜表面检测到BBF，阳性率为81.48%；CRSsNP组25例病人中有14例检测到BBF，阳性率为56.00%；对照组15例病人中未发现BBF。不同组生物膜表达阳性率比较，差异均有统计学意义(χ2=3.957～25.667，P<0.05)。

2.3 鼻腔不同解剖部位BBF表达结果

中鼻甲黏膜表面有16例检测到BBF，阳性率为30.77%；钩突黏膜表面有25例检测到BBF，阳性率为48.08%；筛窦黏膜表面有32例检测到BBF，阳性率为61.54%。中鼻甲BBF表达的阳性率与筛窦比较，差异有显著性(χ2=9.905，P<0.05)。

2.4 实验组中BBF阳性与阴性组临床部分指标的比较

实验组中BBF阳性的CRS病人(36例)鼻部症状评分和鼻窦内镜评分与阴性病人(16例)比较，差异有显著性(t=5.71、t′=6.62，P<0.05)。而有无吸烟史、有无哮喘病史、既往有无鼻窦手术史、病史长短及标本侧CT评分，两组之间比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 实验组中BBF阳性与阴性组临床部分指标比较

3 讨 论

BBF是细菌在不利于其生长的环境中通过产生胞外多聚糖被膜，使其相互粘连而形成的微群落。其可以由单一的菌种组成，也可由多种细菌混合组成。自然界中大约有99%的细菌以生物膜的形式存在，仅1%的细菌以浮游方式生存[12]。临床上许多顽固性、难治性感染都与BBF的形成有关。

近年来，相关研究已经证实CRS病人鼻黏膜存在BBF。SUN等[13]观察了31例CRS病人的手术黏膜样本，结果显示BBF的表达率为64.51%。张孜等[14]用扫描电镜观察了12例CRS病人的手术黏膜样本，结果BBF的表达率为83.3%。本研究利用激光扫描共聚焦显微镜，发现27例鼻息肉病人中22例可以检出BBF，阳性率为81.48%，25例CRS病人中有14例可以检出BBF，阳性率为56.00%，但是对照组15例均没有检测出BBF。本研究实验组与对照组阳性率比较差异有显著性。这与以往文献报道的结果是一致的。提示BBF的存在与CRS的发病尤其是鼻息肉的发病密切相关，BBF可能是CRS的发病原因之一。但也有部分学者研究认为CRS的发病与BBF无相关性[15-17]。这也许是由于检测方法不同导致的。目前检测BBF的主要方法有透射电镜、扫描电镜、原位荧光杂交及激光扫描共聚焦显微镜等。激光扫描共聚焦显微镜可以对细菌及生物膜中各种成分进行不同颜色的荧光染色，且避免对BBF结构的破坏，对标本可以进行无损伤“光学切片”和成像，可做活体研究。HA等[18]认为激光扫描共聚焦显微镜是目前检测鼻窦黏膜BBF的最佳方法。本实验采用活/死菌荧光染色剂，将活体的鼻腔/鼻窦黏膜细胞或细菌染成绿色，将死亡的细胞或细菌染为红色。为保证实验的可靠性，尽可能不破坏BBF在机体内的原始状态，经鼻内镜留取鼻黏膜标本后，立即进行染色及激光扫描共聚焦显微镜镜下观察，标本留取到扫描完成的时间窗控制在60 min内。另外本研究还发现，BBF在筛窦黏膜表达的阳性率较在中鼻甲表达的阳性率明显增高，提示BBF可能更容易定植于鼻腔深部无明显气流的部位。BBF在鼻腔不同解剖部位的表达之前未见报道。这也可以解释为什么鼻息肉组BBF的阳性率更高，因为大部分的鼻息肉起源于筛窦。

CRS病人的病史、主观症状、鼻腔局部检查、影像学检查是反应疾病严重程度、决定治疗方式的重要指征。为了研究BBF与CRS的相关性，本研究采用病史长短、症状评分、Lund-Kennedy鼻内镜评分及Lund-Mackay CT影像学评分等评价指标进行分析。本研究中，生物膜阳性的CRS病人的症状评分、鼻内镜评分与生物膜阴性病人比较，差异有显著性，提示BBF可能与CRS的病情严重程度相关。虽然本研究BBF阳性病人鼻窦影像学评分与阴性病人无明显差异，但是也表现出升高的趋势。

36例BBF阳性的CRS病人中，有鼻窦手术史的病人有6例(16.67%)，而16例BBF阴性的CRS病人中，有鼻窦手术史的病人仅1例(6.25%)，提示BBF的存在增加了CRS的难治性。虽然两组经校正的卡方检验，差异无显著性，但是手术有可能造成鼻窦黏膜的损伤，继而容易导致细菌的定植。因此术者在术中应强化无菌观念，严格无菌技术操作，有鼻腔疾病的病人应保持鼻部清洁，减少CRS的发病风险。在后续研究中，可以通过加大样本量，对手术与BBF关系做进一步的观察。FERGUSON等[19]认为手术是清除CRS病人BBF的唯一手段，但由于目前技术限制，鼻内镜手术过程中发现BBF黏附的确切部位和范围尚未成为可能，BBF的实验室检测手段仍不成熟，无法为临床手术治疗提供有力的支持，手术无法达到彻底清除生物膜的目的。术中残留的BBF成为鼻窦炎复发的隐患，多数状态下细菌蛰伏不表现炎症症状，一旦达到其良好的生长条件，细菌将会以浮游状态再次活跃起来，炎性症状随之出现。BBF的存在，可能是CRS难治的原因之一，也可能是鼻内镜手术后部分病人疗效欠佳的原因之一。

随着近年来对BBF的特性、结构及耐药机制的研究，人们对其有了较深的了解，但是BBF在CRS发病中的具体作用机制尚未完全阐明，未来的研究目标是找到BBF可靠规范的检测标准及方法，同时还应找到BBF形成发生的根源，探讨阻止BBF形成的方法，例如通过药物控制的手段阻止其形成，并进一步探索如何有效清除已存在的生物膜，使CRS得到有效控制。