MUC17基因在胃癌组织、细胞中的表达及对胃癌细胞侵袭增殖能力影响

杨文娟，宋莹，张瑞鑫，郑文英，邓敏

(广州医科大学附属肿瘤医院，广州 510095)

胃癌是临床常见的肿瘤之一，全球病死率高[1]，发病年龄主要集中于40～60岁，男女比例约2∶1。早期胃癌的5年生存率是86.7%，发生远处转移者5年生存率仅20%，因此早期诊断非常重要。癌症的侵袭是各种复杂机制调节的结果，并且是胃癌高病死率的主要原因，也是临床治疗中的重要挑战。原发性癌细胞经历了局部侵袭浸润，渗入血管，通过循环系统输送，再从血管系统外溢这一系列过程达到转移的目的[2]。迄今为止，虽然很多胃癌侵袭性的相关研究，但是胃癌侵袭性的具体机制仍然有很多未知。人黏蛋白17(MUC17)基因是一种黏蛋白基因，定位于人染色体7q22，是黏蛋白家族Mucin中的一员[3,4]。实验分析表明，MUC17基因主要是在消化道中表达，包括十二指肠、回肠和横结肠等[4,5]。尽管MUC17的生理功能尚不完全清楚，但有研究表明它有抗微生物的物理屏障功能和细胞表面传感的功能。MUC17也可以接受细胞外的信号，转换为信号传递到细胞内，从而做出相对应的表达，例如分泌其他黏蛋白产物到细胞外。MUC17与癌症的发病机制也可能有关，有报道[5]显示相较于正常胰腺或者胰腺炎组织，其在PDACs中表达明显异常。近期文献[6]报道，MUC17是PDACs淋巴结转移预后相关的因素之一。本研究观察了MUC17基因在胃癌组织、细胞中的表达及敲低MUC17基因对AGS细胞侵袭、增殖能力的影响，以期为找到新的胃癌新生物标志物。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞、试剂及仪器 选取2013年1月～2015年12月广州医科大学附属肿瘤医院保存的胃癌和癌旁组织各31例份(液氮保存)，每例标本均详细记录了患者的性别、年龄、分期等，所有标本取材前未行新辅助化疗。胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901、BGC823和人正常胃黏膜上皮细胞GES-1保存于广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所细胞库。胰酶、DMEM培养基购于Gibcol公司，胎牛血清购于Hyclone公司，DMSO试剂购于Sigma-Aldrich公司，TRIzol购于Invitrogen公司。细胞培养板、移液管、细胞培养瓶以及冻存管等一次性耗材购自洁特公司。

1.2 胃癌、正常细胞培养 AGS、MKN45、SGC7901、GES-1、BGC823细胞培养条件均为90%高糖DMEM+10%胎牛血清FBS的完全培基培养，培养箱环境均为37 ℃、5%CO2，每2 d换液1次。待细胞汇合度到80%时，取对数生长期的细胞做实验。

1.3 胃癌组织、细胞MUC17基因检测 总RNA的抽提均采用TRIzol法，每5×106个细胞加入1 mL的TRIzol，室温静置10 min后收集于无核酶EP管中。按照5∶1的比例加入氯仿，室温静置10 min后在4 ℃离心机中以12 000 G/min离心，吸取最上层于新的无核酶EP管中。按照1∶1的比例加入异丙醇，充分混匀后静置10 min，12 000 G/min室温离心5 min，倒掉上清，沉淀用75%酒精重悬,再以7 500 G/min离心，弃掉上清，加入无核酶水溶解沉淀，得到的为总RNA，在NANO Drop中测RNA浓度，RNA保存于-80 ℃。总RNA逆转录按Takara逆转录试剂盒TAKARA PrimeScriptTM RT Master Mix操作说明书操作，体系为5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，Total RNA 0.5 μ g,使用无核酶水补足20 μL体系；反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。Real-time PCR按TAKARA SYBR®Premix Ex Taq®(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书操作，PCR反应采用ABI 7500real-time PCR系统。反应体系为SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol)1 μL，PCR Forward Primer(10 μmol)1 μL，cDNA 1 μL，H2O up to 20 μL。每个样品设置3个副孔。反应条件为两步法：预变性95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，65 ℃、15 s，共40个循环。退火后采集荧光信号，每组设3个复孔，实验重复3次，取均值。

1.4 AGS细胞转染及分组 取对数生长的AGS细胞接种于六孔板中，待细胞长到80%汇合度时使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)将siMUC17以及对照siNC序列转染入细胞中(分别计为观察组和对照组)，以敲低MUC17基因。将AGS siMUC17细胞记为观察组，AGS siNC细胞记为对照组。

1.5 AGS细胞侵袭能力观察 ①MUC17基因：采用Western blotting法。利用总蛋白抽提试剂盒提取总蛋白，PierceTMBCA Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白质浓度，取30 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，凝胶浓缩层使用80 V恒压，分离层改用120 V恒压，待溴酚蓝指示剂跑到了距底层1 cm处即可结束电泳。120 V恒压冰水浴中转膜90 min。用TBS配制5%的脱脂牛奶封闭1 h。分别加入兔抗人MUC17单克隆抗体(美国Abcam)及鼠抗人β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology)。4 ℃孵育过夜，第2天使用TBST洗膜3次，每次10 min。用已稀释的荧光二抗在室温避光孵育2 h，使用TBST洗膜3次，每次10 min，后使用荧光自动显影成像。②侵袭细胞数：使用有基质胶的Transwell chamber。往每个Transwell小室加50 μL无血清培养基以水化基底膜，置于37 ℃培养箱30 min。消化所需细胞，终止消化后离心，弃培养基，用PBS洗2片以去除血清影响，用含1%FBS的DMEM培养基重悬细胞，进行细胞计数。将重悬的细胞加入Transwell小室，每孔1×105个细胞。于Transwell下室加入15%FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。培养48 h后，弃上室液体，用PBS洗涤3次，甲醇固定30 min，用棉签擦去上室细胞，加入1%结晶紫染色10 min，PBS洗3遍。拍照，并随机选取5个视野进行计数。③划痕愈合率：取对数生长期的观察组和对照组细胞，每孔2×105个种于六孔板中。待细胞汇合率达90%时，用10 μL规格移液枪枪头对细胞进行划痕，宽度控制在1 mm左右。用PBS冲洗3遍，洗去因划痕脱落的细胞及碎片。弃去PBS，每孔加入2 mL无无血清培基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，分别于8、16、24、28、32、36 h于倒置显微镜下观察并拍照。

1.6 AGS细胞增殖能力观察 ①细胞增殖率：采用MTS法检测。取对数生长期的AGS siMUC17细胞、AGS siNC细胞，种于96孔板中，每孔500个细胞，各6个复孔，于37 ℃、5%CO2培养箱培养。待细胞贴壁，分别于0、1、2、3、4、5、6 d每孔加入20 μL MTS溶液，在培养箱里孵育2.5 h后，在多功能酶标仪上检测各孔OD490值。将所得OD490为纵坐标，检测时间为横坐标绘制细胞生长曲线。②形成克隆的数量：采用平板克隆实验检测。将AGS siNC细胞和AGS siMUC17细胞分别接种于6孔板，750个细胞/孔。置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔3 d换液1次。15 d后，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞1次，每孔加入400 μL甲醇，-20 ℃固定20 min。弃去甲醇，每孔加入400μL 1%结晶紫染色液，室温染色10 min。弃去结晶紫染色液，缓慢流动水漂洗6孔板5 min。观察实验结果。

2 结果

2.1 胃癌组织、细胞中MUC17基因相对表达量比较 胃癌、癌旁组织MUC17基因相对表达量分别为5.9±1.0、1.8±0.4，两者比较，P<0.05。AGS、SGC7901、BGC823、MKN45、GES-1细胞中以GES-1细胞为参照，MUC17基因相对表达量分别为37.2±4.6、21.0±2.5、3.4±1.2、1.7±0.75，P均<0.05。

2.2 两组AGS细胞MUC17蛋白表达、侵袭细胞数、迁移距离比较 结果见表1。

表1 两组AGS细胞MUC17蛋白表达、侵袭细胞数、划痕愈合率比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组AGS细胞增殖率、克隆形成能力比较 结果见表2。

表2 两组AGS细胞增殖率、克隆形成能力比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，病死率在所有癌症中排第三[7]。由于早期胃癌临床症状不明显，多数发现已属晚期[8]。胃癌是多因素致病的一种疾病，根据细胞形态与组织化学分为肠型和弥漫型两类[9]，世界卫生组织根据病理特点将其划分为管状、乳头状、黏液性、印戒细胞癌。胃食管反流病、胃炎、幽门螺杆菌感染以及糖尿病等，都是胃癌的高危因素[10]。

既往研究[11,12]表明，Mucin是由自身组织上皮细胞合成及分泌，并在胃肠道、乳腺、胰腺等细胞表面广泛分布及表达的高分子量的糖蛋白。迄今为止，已发现20种Mucin基因，即MUC1、MUC2, MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20，MUC17是膜连接黏蛋白，由位于7号染色体的q22位点的MUC17基因编码。MUC17主要表达于在十二指肠、结肠和末端回肠[13]。在上皮细胞中MUC17起到提供信号转导的功能，维持空间结构，保护细胞，使肿瘤细胞有抗黏附的能力从而使肿瘤细胞失去极性[14]。文献[15]报道，MUC17也有维持肠上皮完整性的作用。有研究[14,16]显示，MUC17在胰腺癌中呈低表达。

本研究显示，与癌旁组织比较，胃癌组织MUC17基因表达升高；与GES-1细胞比较，AGS、MKN45、BGC823、SGC7901细胞MUC17基因表达升高。与对照组比较，观察组AGS细胞MUC17表达降低，侵袭细胞个数减少，细胞划痕愈合率及细胞增殖率降低，克隆形成能力减弱。这提示MUC17或将可能成为胃癌治疗的新靶标。

总之，MUC17在胃癌组织和细胞中表达上调，敲低MUC17表达可抑制AGS细胞的侵袭和增殖能力。关于MUC17促进胃癌细胞增殖和侵袭能力的具体机制尚未明确，还需进一步深入探究。