EIF4A1在胃癌组织中表达及其抑制剂对人胃癌细胞株增殖、存活、侵袭、迁移能力影响观察

韦尉元，陈建思，覃宇周，莫显伟，严林海，肖强,2

(1广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021；2广西医科大学第一附属医院)

胃癌是常见的消化道肿瘤之一，在中国、日本和韩国等地区仍维持较高的发病率，目前我国每年新发病例超过47万例，病死率为33.93/10万，严重危害人民健康和生命。临床上主要采用手术、化疗和放疗等综合手段治疗胃癌，而对于中晚期胃癌，随着病情发展，会出现手术禁忌、化疗耐药、放疗不敏感，使上述方法控制胃癌进展的效果非常有限，最终避免不了发生转移，其发生机制与多种基因突变和信号通路调控异常密切相关[1,2]。近年来，阻断剂干预与肿瘤发生发展密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿瘤增殖生长、侵袭及转移的效果，为肿瘤的防治提供了新的治疗途径[3]。前期研究表明，微小RNA1284(miR-1284)过表达靶向下调真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)表达，发挥抑制胃癌侵袭、迁移和增加化疗药物诱导细胞凋亡作用[4]，提示EIF4A1可能与胃癌的转移相关。文献[5]报道，EIF4A1可被Silvestrol结合，从而抑制EIF4A1的活性。但EIF4A1及其药物抑制剂Silvestrol在胃癌中的作用及机制尚未见报道。本研究采用免疫组化法检测淋巴结转移阳性或阴性胃癌患者肿瘤组织EIF4A1，分析其与胃癌淋巴结转移的相关性；另通过Silvestrol干扰人胃癌细胞株SGC-7901，观察其对细胞增殖、存活、侵袭、迁移能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本 选择2013～2015年广西医科大学附属肿瘤医院留存的淋巴结转移阳性、阴性胃癌组织标本各20例份，另取匹配的癌旁(距癌组织4 cm)正常组织各20例份，标本直径均为0.5 cm，以10%的甲醛固定。所有胃癌标本均经过病理诊断确认，且患者均签订知情同意书。

1.2 细胞、主要试剂及抑制剂 SGC-7901细胞；EIF4A1，蛋白激酶B(AKT)，GAPDH基因兔抗人抗体，羊抗兔二抗IgG抗体，逆转录试剂盒及扩增试剂盒，即用型SP免疫组化试剂盒，Silvestrol。

1.3 胃癌组织EIF4A1检测 采用免疫组化法。切取4 μm厚的切片，贴于防脱玻片上，64 ℃烤片3 h。常规脱蜡、修复、封闭，滴加1∶300比例的一抗EIF4A1稀释工作液，在37 ℃孵育1～2 h(或4 ℃湿盒内过夜)，用PBS缓冲液代替一抗做阴性对照，孵育过夜，PBS冲洗3次。滴加1∶500比例的生物素标记二抗稀释工作液孵育。加DAB溶液显色液，显微镜下观察显色。蒸馏水洗涤以终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水浸泡蓝化。脱水、透明及封片。根据阳性细胞数和染色强度确定基因表达程度，两种评分相加所得的总分值即为最后的评分结果，同一患者的胃癌组织和匹配癌旁正常组织的进行总分值比较，如两者分值不一样，得分高者为高表达，得分低者为低表达；如两者总分值一样，且分值≤3分，两者都评定为低表达；如两者总分值一样，且分值>3分，两者都评定为高表达。

1.4 SGC-7901细胞增殖活性检测、活细胞数计数、侵袭细胞数测算、迁移距离测量 ①SGC-7901细胞增殖活性：采用CCK-8法。使用RPMI1640(含10%胎牛血清)培养液，将SGC-7901细胞培养于5%CO2、37 ℃的培养箱中。细胞培养至对数生长期，常规胰酶消化细胞，用培养基调整细胞浓度至3 000个/100 μL。以每孔100 μL接种于96孔板，每组设5个复孔，药物组加含120 μg/mL的Silvestrol(在DMSO溶剂溶解)细胞培养液100 μL，模型组加含0.5%DMSO的细胞培养液100 μL，对照组加细胞培养液100 μL。置于恒温培养箱中(37 ℃、5%CO2)，孵育常规培养。48 h后吸净孔中原培养液，加无血清培养基90 μL，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在孵育箱内继续孵育1 h后，测定450 nm波长处吸光度值(OD值)，各组细胞增殖能力以OD值表示。②SGC-7901细胞活细胞数计数：采用Countess Ⅱ FL细胞计数仪。按“①”方法将培养细胞分组并进行干预，48 h后常规胰酶消化各孔细胞，离心，把各孔细胞总液体体积调为1 mL，充分吹打均匀，取其中的10 μL细胞悬液加到已含10 μL的台酚蓝PCR管中，充分吹打均匀，取其中10 μL加到细胞计数板上，Countess Ⅱ FL细胞计数仪检测各组活细胞数。③SGC-7901细胞侵袭细胞数测算：采用Transwell侵袭实验。取Corning小室(孔径8 μm)，在小室滤膜上铺一层Matrigel(用无血清培养液1∶4稀释，75 μL/孔，37 ℃温育30 min，形成胶状)。按“①”方法将培养细胞分组并进行干预，48 h后常规胰酶消化各孔细胞，离心，各组细胞用培养基调整细胞浓度至6×105个/100 μL。在上室孔中加入各组细胞悬液100 μL(6×105/孔，无血清培养基的单细胞悬液)。每组设4个复孔。下室中加入含10%血清的培养液600 μL，培养24 h后用冰预冷的甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色15～20 min，用PBS洗3遍以上，显微镜100倍下拍照。随机选取10个视野进行细胞计数，计算平均每个视野侵袭细胞数，各组细胞侵袭能力以侵袭细胞数表示。④SGC-7901细胞迁移距离测量：采用划痕实验。取对数生长期的SGC-7901细胞，常规胰酶消化细胞用于实验，细胞用培养基调整细胞浓度至6×105个/100 μL，以6×105个/孔分别相应的接种到6孔板中，药物组加含120 μg/mL Silvestrol的培养液100 μL和含60 μg/mL Silvestrol的培养液1 000 μL，模型组加含0.5%DMSO的细胞培养液100 μL和含0.25%DMSO的细胞培养液1 000 μL，对照组加细胞培养液1 100 μL，每组细胞设3个复孔。37 ℃孵育24 h，用200 μL移液器枪头于培养板底部划“一”形痕，PBS冲洗2遍，彻底洗脱悬浮细胞，分别于培养至48 h，应用相差显微镜拍摄划痕边缘进展情况，NIH图像处理软件分析细胞迁移程度，以48 h后各组细胞划痕边缘的两边平均距离表示细胞迁移能力, 划痕边缘距离越大，迁移能力越弱。

1.5 SGC-7901细胞EIF4A1和AKT mRNA、蛋白检测 ①EIF4A1、AKT mRNA检测：采用qRT-PCR法。按“1.4中①方法”将培养细胞分组并进行干预，48 h后常规胰酶消化各孔细胞，离心，收集各组细胞，采用TRIzol法提取各组细胞总RNA并检测RNA的纯度及浓度。逆转录和PCR反应均严格按照TaKaRa公司提供的说明书，以GAPDH作为内参进行相对定量，每组设3复孔，在Roche实时定量荧光PCR仪上进行检测。采用2-ΔΔCT法计算各组蛋白的相对表达量，以相对表达量表示EIF4A1、AKT mRNA表达情况。②细胞EIF4A1、AKT蛋白检测：采用Western blotting法。按“1.4中①方法”将培养细胞分组并进行干预，48 h后常规胰酶消化各孔细胞，离心，收集各组细胞，按照蛋白提取试剂盒说明提取各组细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。取150～250 μg蛋白在10%SDS-PAGE胶上电泳，后转移至聚偏二氟乙烯膜，用一抗稀释液分别加入兔抗人EIF4A1、AKT、GAPDH基因抗体，于4 ℃孵育过夜；用TBST洗涤膜5次，再加入羊抗兔抗体IgG(1∶12 000)，常温孵育30 min，胶片曝光显影，GAPDH为内参照，以EIF4A1、AKT的条带灰度值相对表达量表示EIF4A1、AKT的蛋白表达情况。

2 结果

2.1 胃癌、癌旁正常组织中EIF4A1表达比较 淋巴结转移阳性胃癌组织及癌旁正常组织中EIF4A1高表达分别为17例(85.0%)、3例(15.0%)，两者比较，P<0.05；淋巴结转移阴性胃癌组织及癌旁正常组织中EIF4A1高表达分别为11例(55.0%)、9例(45.0%)，两者比较，P﹥0.05。

2.2 各组细胞OD值及活细胞数比较 结果见表1。由表1可知，各组OD值及活细胞数两两比较，P均>0.05。

表1 各组细胞OD值及活细胞数

2.3 各组细胞侵袭细胞数、细胞迁移距离比较 结果见表2。

表2 各组细胞侵袭细胞数、细胞迁移距离比较

注：与其余两组比较，*P<0.05。

2.4 各组EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表达比较 结果见表3。

表3 各组EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表达比较

注：与其余两组比较，*P<0.05。

3 讨论

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，尽管发病率在全球呈下降趋势，但在中国、日本和韩国等地区仍较高，胃癌组织细胞学分类较多，其中SGC-7901细胞是胃癌的一种细胞类型，于1979年建系，源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移灶，使用含10%的胎牛血清RPMI1640培养，SGC-7901细胞在免疫抑制的小鼠皮下及腹腔可移植成功，是被研究者广泛应用的一种细胞模型。

EIF4A1是真核翻译起始因子4A(EIF4A)家族的重要成员之一，EIF4A解旋酶家族成员在序列上存在高度同源，哺乳动物中存在EIF4A1、EIF4A2、EIF4A3共3种EIF4A形式，人类EIF4A1和EIF4A2属于胞质蛋白，两者的同源性较高，EIF4A3蛋白主要定位在核内，与EIF4A1的同源性较低，其发挥作用需与多种真核翻译起始因子蛋白结合[6]。同时研究[7]表明，在不同细胞状态下，EIF4A1和EIF4A2表达不同，EIF4A1在生长活跃的细胞中高表达，而EIF4A2在生长停滞的细胞中高表达，敲除EIF4A1可抑制细胞生长，敲除EIF4A2不能影响细胞生长，提示EIF4A1被激活是促进蛋白翻译，可能加速肿瘤细胞恶性生长发挥重要作用。前期我们研究也表明，miR-1284过表达可下调EIF4A1基因表达而发挥抑制胃癌侵袭迁移[4]，提示EIF4A1可能与胃癌的转移相关；同时研究[5]报道，EIF4A1可被来自植物的提取的药物Silvestrol结合，从而抑制EIF4A1基因的活性，因此探讨EIF4A1在胃癌中表达及其抑制剂的作用可为胃癌的研究提供重要的科学理论。本研究显示，EIF4A1在淋巴结转移阳性的胃癌组织中表达量高于癌旁正常组织，而在淋巴结转移阴性的胃癌组织及癌旁正常组织中的表达无差异，提示EIF4A1高表达可能有助于胃癌细胞的转移。

文献[8]报道，敲除EIF4A1可降低AKT、ERKs蛋白的表达及活性；同时也有研究表明，AKT可激活mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)的表达，而启动mTOR信号通路调控内皮细胞Jagged1蛋白重新恢复表达，促进血管平滑肌细胞生成[9,10]，血管是保障肿瘤营养的重要渠道，临床上通过介入治疗阻塞血管达到控制肿瘤效果。同时，Jagged1是Notch受体其中的一个主要配体，通过与邻近细胞表面Notch受体结合，启动Notch信号通路。Notch1信号通路激活可直接或间接调控下游基因DEPTOR、c-Myc促进T细胞白血病细胞增殖和存活[11,12]。研究[13]也表明，抑制Notch1表达可以降低胃癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力，减少胃癌上皮间质转化的发生。有研究[14]证实，在进展期乳腺癌和前列腺癌中AKT可通过E-钙黏蛋白CDH1而调控Skp2的表达，而JUN积聚程度依赖于激活型CDH1在细胞间粘合作用效果，JUN表达下调可抑制VEGF和MMP蛋白表达，下调MMP和VEGF的表达可以抑制胃癌细胞侵袭和迁移[15]。我们前期研究[16,17]也发现，Jagged1、Notch1、c-Myc、CDH1基因与胃癌细胞增殖、存活、迁移和侵袭密切相关。本研究显示，与模型组、对照组比较，药物组侵袭细胞数少，细胞迁移距离长，EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表达降低。提示Silvestrol可抑制SGC-7901细胞侵袭、迁移能力，其机制可能与降低EIF4A1、AKT表达有关。