组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肺癌细胞株MDR1、MRP1表达的影响及其机制

石斌，王昊，赵亮，冯晓俊

(安徽省立医院，合肥 230001)

肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤之一，化疗是治疗肺癌的主要方法，而多药耐药性的产生是肺癌化疗治疗过程中的最大障碍[1,2]。ATP结合盒(ABC)外排蛋白家族在多药耐药的产生过程中发挥极为重要的作用，其中多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)与化疗耐药性的关系更为重要，分别由ATP结合盒超级家庭B成员1和ATP结合盒超级家庭C成员1编码[3～7]，在多种肿瘤组织中呈现高表达的状态，并与肿瘤的预后密切相关[3～12]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类新型的强效抗肿瘤药物，包括伏瑞斯特(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)等，其通过促进肿瘤分化、凋亡和细胞周期阻滞，抑制血管形成等达到抗肿瘤的目的，在多种肿瘤细胞中展示出了强力的抗肿瘤效应[13～15]。本研究观察了SAHA和TSA对肺癌细胞中MDR1、MRP1表达的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SAHA和TSA购自Sigma-Aldrich公司；抗体MDR1和GAPDH购自Cell Signaling Technology公司；抗体MRP1购自Bioworld公司；抗体蛋白去乙酰化酶1、2、3、4(HDAC1、2、3、4)购自华安生物公司；荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 细胞培养 肺癌细胞A549和SK-mes-1购自上海细胞库。培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天用0.25%的胰酶消化传代。

1.3 肺癌细胞存活力检测 采用CCK8法。A549、SK-mes-1细胞以每孔7×103/mL接种于96孔细胞培养板，贴壁生长后，用SAHA(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)和TSA(0、50、100、200、400、800 nmol/L)处理24 h，设5个复孔，设立空白对照组。加药处理后每孔加10 μL CCK8试剂，继续培养4 h，用450波长的酶标仪检测OD值，实验重复3次，取平均值。

1.4 肺癌细胞MDR1和MPR1基因检测 采用荧光定量PCR法。分别用0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA处理A549细胞、SK-mes-1细胞24 h，按照TRIzol说明书方法提取两个细胞RNA，逆转录为cDNA。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40个循环。引物序列为：MDR1正义链：5′-TGCTCAGACAGGATGTGAGTTG-3′；反义链：5′-AATTACAGCAAGCCTGGAACC-3′；MRP1正义链：5′- GCCAAGAAGGAGGAGACC -3′；反义链：5′- AGGAAGATGCTGAGGAAGG-3′。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算MDR1和MPR1基因 mRNA 的相对表达量每个实验组重复3次，取平均值。

1.5 肺癌细胞MDR1、MPR1蛋白和HDAC1、-2、-3、4及2MeH3K9蛋白检测 采用Western blotting法。分别用0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA处理A549、SK-mes-1细胞24 h，用预冷PBS洗涤细胞3次，用蛋白裂解液裂解，离心后收集上清；等量蛋白样品经过SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，封闭液室温孵育2 h，MDR1、MPR1及HDAC1、2、3、4和2MeH3K9抗体均以1∶1 000孵育过夜，经PBST洗涤后，加入二抗以1∶5 000室温孵育1.5 h，PBST洗涤3次，最后用ECL化学发光试剂在自动曝光仪中曝光，以GAPDH作为内参，用Image J软件对每个蛋白条带的灰度进行分析，计算MDR1、MPR1、HDAC1、2、3, 、4和2MeH3K9的相对表达值，每个实验组重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 肺癌细胞存活力比较 结果见表1，由表1可知，0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA对A549细胞和SK-mes-1细胞的存活力没有明显影响，因此我们挑选这个浓度进行下一步的实验。

表1 不同浓度SAHA、TSA作用于肺癌细胞后OD值比较

2.2 肺癌细胞中MDR1表达比较 DMSO处理的A549、SK-mes-1细胞中MDR1基因相对表达量分别为1.0±0.09、1±0.08，SAHA处理的分别为32.25±2.56、8.18±0.82，TSA处理的分别为37.86±3.58、7.85±0.68，与DMSO比较，SAHA、TSA处理后MDR1基因表达增高(P均<0.05)。DMSO处理的A549、SK-mes-1细胞中MDR1蛋白相对表达量分别为1.0±0.03、1±0.04，SAHA处理的分别为2.75±0.16、3.42±0.25，TSA处理的分别为3.16±0.23、2.13±0.21，与DMSO比较，SAHA、TSA处理后MDR1蛋白的表达增高(P均<0.05)。说明SAHA及TSA可以明显增加A549、SK-mes-1细胞中MDR1的基因和蛋白表达。

2.3 肺癌细胞中MRP1表达比较 DMSO处理的A549、SK-mes-1细胞中MRP1基因相对表达量分别为1.0±0.03、1±0.05，SAHA处理的分别为0.56±0.09、0.61±0.08，TSA处理的分别为0.47±0.08、0.54±0.07，与DMSO比较，SAHA、TSA处理后MRP1基因表达减少(P均<0.05)。DMSO处理的A549、SK-mes-1细胞中MRP1基因相对表达量分别为1.0±0.06、1±0.08，SAHA处理的分别为0.32±0.05、0.45±0.07，TSA处理的分别为0.21±0.06、0.58±0.07，与DMSO比较，SAHA、TSA处理后MRP1蛋白表达减少(P均<0.05)。说明SAHA和TSA可以明显减少A549细胞和SK-mes-1细胞中MRP1的基因和蛋白表达情况。

2.4 肺癌细胞中组蛋白乙酰化和甲基化的比较 DMSO处理的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4及2MeH3K9相对表达量分别为1.0±0.05、1±0.06、1.0±0.04、1±0.06、1±0.03，SAHA处理的分别为0.96±0.11、0.92±0.08、0.35±0.07、0.32±0.09、3.67±0.21，TSA处理的分别为0.96±0.08、0.95±0.08、0.22±0.03、0.09±0.02、2.35±0.15，与DMSO比较，SAHA、TSA处理后HDAC3、HDAC4蛋白表达减少，2MeH3K9蛋白表达增多(P均<0.05)。说明HDAC3、HDAC4和2MeH3K9可能在组蛋白去乙酰化酶抑制剂引起肺癌细胞中MDR1上调和MRP1下调过程中发挥了重要作用。

3 讨论

肺癌是全球范围内危害较大的恶性肿瘤，肺癌的发病率和病死率在全球范围内一直处于较高的状态，化疗是治疗肺癌的重要方法。顺铂是肺癌化疗的首选药物，顺铂与肿瘤细胞中DNA交叉连接，形成复合物，阻断肿瘤细胞DNA的复制，最终引起肿瘤细胞凋亡[16]。晚期肺癌的5年生存率较差，主要原因是化疗耐药性的产生。肺癌患者经过初期化疗后，肿瘤进程得到控制，但经过一段时间的持续给药治疗后，就会对化疗药物的敏感性降低，获得耐药性，最终达不到预期治疗效果，耐药性的产生最终导致了肺癌的治疗失败。

组蛋白去乙酰化酶是机体内调控组蛋白乙酰化状态的关键酶，作用是抑制组蛋白乙酰化，紧致核小体的结构，抑制基因转录。在肿瘤组织中，由于组蛋白去乙酰化酶的过度表达导致了抑癌基因的表达受到了抑制，从而促进肿瘤的发生。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类新型的强效抗肿瘤药物，主要通过促进组蛋白乙酰化，激活抑癌基因，从而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡。SAHA是第一个被美国食品药品管理局批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，目前已经用于乳腺癌、白血病以及结直肠癌等的治疗[17,18]。TSA是链霉素代谢产物，也是第一个来源于天然产物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可特异性抑制哺乳动物组蛋白去乙酰化酶，使组蛋白高乙酰化，激活基因表达，抑制细胞增殖，引起细胞分化或凋亡，与传统的细胞毒性抗肿瘤药物比较有明显的特点和优势，对多种实体瘤及血液系统肿瘤具有显著抑制作用[19～21]，因而被认为是一种非常有前景的新型抗肿瘤药物。

化疗耐药性的产生是制约化疗疗效的关键因素，ABC外排蛋白的过度表达是形成化疗耐药的主要原因。MDR1是研究最为广泛的ABC外排蛋白，它的作用底物包括天然毒素、抗肿瘤药物以及它们的代谢产物，MRP1的作用底物是许多有毒化合物的谷胱甘肽结合物，MDR1和MRP1这两个重要的ABC外排蛋白在ATP能量代谢的作用下，将结构和功能不同的化疗药物从细胞内转移到细胞外，减少了药物的有效杀伤浓度，从而导致多药耐药的产生。MDR1和MRP1涉及了各种化疗药物所引起的化疗耐药性产生的机制。虽然组蛋白去乙酰化酶抑制剂是新型的一类强效抗肿瘤药物，但化疗耐药性的产生是一个普遍问题，组蛋白去乙酰化酶抑制剂也不例外。曾有研究[22～24]报道，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增加不同细胞中的MDR1表达。另外有一些研究[22,25]发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对不同细胞中的MRP表达也有影响。本研究显示，SAHA和TSA可以增加肺癌细胞中MDR1表达，却抑制MRP1表达，因为MDR1和MRP1作用底物不同，可以将不同的药物外排出体外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂增加了MDR1表达而减少了MRP1的表达，当组蛋白去乙酰化酶抑制剂和MDR1的作用底物药物共同用药时，可能会引起多药耐药现象，反之当组蛋白去乙酰化酶抑制剂和MRP1的作用底物药物共同用药时可以有效抑制多药耐药产生。

组蛋白的乙酰化和甲基化在蛋白表达过程中发挥了重要的作用，组蛋白去乙酰化酶可以通过抑制组蛋白乙酰化，抑制基因转录表达。常见的组蛋白乙酰化酶包括HDAC1、2、3、4，这些组蛋白乙酰化酶通常在肿瘤组织中呈现高表达的状态，使机体处于去乙酰化状态，很多抑癌基因的表达受到了抑制，从而导致肿瘤的发生发展[26,27]。组蛋白的甲基化往往促进基因的表达，如组蛋白H3上赖氨酸位点的甲基化2MeH3K9参与调控了多个基因的表达。本研究显示，SAHA和TSA可以下调肺癌细胞中HDAC3和HDAC4的表达，促进了2MeH3K9的表达，对HDAC1和HDAC2表达没有明显影响，我们推测SAHA和TSA引起MDR1和MRP1不同表达的原因可能和这个机制有关，后续的实验很有必要继续深入探讨潜在的机制。

总之，SAHA和TSA可以促进A549、SK-mes-1细胞中MDR1表达上调和MRP1表达下调，机制可能是其可促进组蛋白的乙酰化和甲基化。