温度对豚鼠心肌细胞快激活延迟整流钾电流的调节

王小艳，吴婷婷，庞斯斯，王 森

(南京医科大学第一附属医院 老年医学科，江苏 南京 210029)

快激活延迟整流钾电流(Ikr)是心肌细胞复极化的主要电流，抑制Ikr可使动作电位时程延长，引起早后除极，致心律失常的发生。编码人类心肌细胞Ikrα亚单位的基因为hERG(human ether-a-go-go-related gene, 或KCNH2)[1]。该基因突变可导致遗传性长QT综合征- 2 LQTS- 2，而许多抗心律失常药物及非抗心律失常药物对hERG通道的过度抑制是获得性长QT综合征的主要发病机制[2- 3]。将hERG基因转染至中国仓鼠卵母细胞(CHO)上发现hERG电流及其门控特性受温度的影响较大[4]。本实验观察在不同实验温度下心肌细胞Ikr电流的大小以及门控特性，为进一步研究心肌细胞Ikr提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性豚鼠[南京医科大学实验动物中心，生产许可证号：SYXK(苏)2013-0015]，体质量250～350 g。

1.1.2 溶液：含钙台式液成分(mmol/L, pH 7.4): NaCl 143、 KCl 5.4、 NaH2PO40.25、HEPES 5.0、 MgCl20.5、CaCl21.8和D-glucose 5.6; 无钙台式液为含钙台式液中不加CaCl2。电极内液(mmol/L, PH 7.4): KCl 140、 CaCl21、 MgCl22、 HEPES 10、 EGTA 11、 Na2-ATP 5和creatine phosphate(disodium salt) 5; 电极外液(mmol/L,PH 7.4) NaCl 140、 KCl 3.5、 CaCl21.5、 MgSO41.4、 HEPES 10, 另外加入10 μmol/L nifedipine阻断L型钙电流以及10 μmol/L chromanol 293B阻断慢激活延迟整流钾电流。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室肌细胞分离：采用酶解法制备心室肌单细胞。取豚鼠心脏,置4 ℃台式液中，心脏稍加修饰后连于Langendorff灌流装置上，经主动脉逆向灌流，灌流速度为7 mL/min，先以含钙台式液灌流2 min，继以无钙台式液灌流5 min，心脏逐渐停止跳动，予含II型胶原酶0.4 mg/mL和牛血清白蛋白1 mg/mL的无钙台式液消化10～15 min，剪下左心室置于KB液中，将左心室组织剪成小碎块，轻轻吹打3～5 min，以200目尼龙网过滤，500 r/min离心后弃上清液，加入新的KB液。室温保存2 h后选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩的细胞用于全细胞膜片钳的记录。整个灌流过程中持续通氧，灌流液温度保持在37 ℃左右。

1.2.2 离子通道电流的记录：应用全细胞膜片钳记录快激活延迟整流钾电流。膜片钳放大器(HEKA，EPC9,Germany)同计算机连接。刺激信号及电压输入信号的采集均由软件(Pulse, Pulse-Fit V8.53)控制。膜片钳参数为：钳制电压-40 mv，预刺激从-40 mv至+40 mv，脉宽200 ms，刺激从相应电压降至-40 mv，脉宽600 ms，记录外向尾电流。

2 结果

2.1 快激活延迟整流钾电流(Ikr)记录及验证:常温下记录到的Ikr尾电流，Ikr特异性阻断剂多非利特dofetilide(1 μmol/L)可完全阻断该电流，证明该部分电流即为纯的Ikr尾电流(图1)。

2.2 温度对Ikr尾电流的影响:Ikr尾电流对温度极为敏感，在温度为22 ℃～37 ℃，Ikr尾电流随着温度的升高(22 ℃, 27 ℃, 32 ℃, 37 ℃)而增大(图2A)。当预刺激电压为+40 mV时，Ikr电流密度由22 ℃时的(0.27±0.15)pA/pC增加到37 ℃时的(0.62±0.15)pA/pC(P<0.01)(图2B)。半数最大激活电压(V0.5)从22 ℃时的(-3.59±4.20)mV变为37 ℃时的(-4.45±3.53)mV(图2C)，slope factor(k)从17.38±3.98变为10.19±3.15(P<0.01)(图2D)。

Recording of Ikr tail current in the same cell before(A) and after (B) superfusion with dofetilide at room temperature

A.representative Ikr tail current traces recorded at different temperature； B.the current density induced by depolarizing voltage clamp pulse +40 mV at 22 ℃ and 37 ℃； C.the half-maximal activation voltage(V0.5) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃; D.the slope factor (k) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃； *P<0.01 compared with 22 ℃

3 讨论

Ikr钾通道对于正常心脏的电生理活动是必需的，它介导了动作电位3期的复极化，且它是唯一可在每一次动作电位末尾时调控细胞膜复极的电流，对心率的调节及维持细胞的兴奋性起重要作用。目前国内外鲜有关于温度对Ikr电流的调控的研究，将hERG基因转染到中国仓鼠卵母细胞上，研究温度对HERG电流的影响，发现温度升高后，herg的激活曲线向超极化的方向移动，而失活曲线向去极化的方向移动[4]。然而，虽然转染细胞在研究通道、分子机制方面有强大的优势，然而钾通道还存在调节亚单位(β亚单位)如minK,miRP1、激酶结合蛋白、细胞支架成分以及其他的一些蛋白，这些物质在转染细胞与心肌细胞中有很大的不同，因此，直接对心肌细胞进行研究快激活延迟整流钾电流很有必要的。

本实验发现，Ikr电流受温度的影响较大，随着温度的升高，Ikr电流明显增加，同时半数最大激活电压(V0.5)和slope factor(k)均随温度升高而更小，电压激活曲线向更负的方向移动。提示当细胞所处环境的温度从22 ℃升至37 ℃，细胞内的Ikr离子通道更加易于开放，且开放的数量明显增加，从而介导Ikr电流明显增加。因此，一定范围内的温度变化可以调节单个心肌细胞表面离子通道的启闭，影响离子通道的电学特点，介导离子流大小的改变，从而影响整体心肌的电活动和动作电位，甚至整体心脏的电生理特征。

有报道，在记录离子流时所采用的温度不尽相同，有在室温下，也有在生理温度下进行。本研究提示，在记录Ikr电流时，实验环境温度影响电流强度。深入了解温度对离子通道的影响及机制，可更深入了解心肌细胞的电学特性。