血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3在乳腺癌分子诊断与治疗中的意义

郭红艳 高 涵 吴 琦 孙晓杰 刘秀财 赵立群

(齐齐哈尔医学院生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

乳腺癌的分子诊断与靶向治疗是近年研究的主要方向〔1,2〕，血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK)3是PI3K信号通路中的下游分子，与Akt 平行，SGK3与多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展相关，正逐渐成为肿瘤研究领域的新靶点〔3～6〕。SGK3高表达可促进MCF-7细胞增殖、抑制其凋亡〔7〕，SGK3在乳腺癌组织中的表达高于正常组织，且与雌激素受体(ER)表达相关。本文在细胞水平观察SGK3过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231恶性生物学能力的影响，并利用组织芯片检测SGK3在不同临床病理TNM分级的浸润性乳腺癌中的表达并分析其与某些临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1实验材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-231由中国医学科学院肿瘤研究所提供，pEGFP-N1-SGK3重组质粒由本课题组构建，乳腺癌组织芯片(BR1503d)购Alenabio公司，SGK3抗体购自Proteintech公司，UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒为Maixin Bio公司产品，细胞培养瓶、培养板为Nunc公司产品。

1.2细胞转染与分组 利用酶切鉴定、DNA测序等确定成功构建真核表达载体pEGFP-N1-SGK3，将其和空载体pEGFP-N1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞，细胞分为MDA-MB-231组；转染空质粒pEGFP-N1组，转染重组质粒pEGFP-N1-SGK3组。

1.3划痕实验 参考Feng等〔8〕方法，将生长状态良好的细胞按每孔1×105植于6孔培养板上，细胞长至60%～70%汇合，形成单细胞层，用无菌20 μl枪尖在单层细胞划痕(每孔划2条)，磷酸盐缓冲液(PBS)洗掉脱壁细胞后继续培养，分别在划痕后0、12和24 h显微镜下照相监测，观察划痕的修复情况。

1.4细胞周期分析 参考Pan等〔9〕方法，细胞培养48 h，0.25%胰酶消化处理各组培养细胞，1 000 r/min离心10 min收集细胞，用冰预冷的PBS洗两次，PBS悬浮细胞，PI染色，30 min后上流式细胞仪检测细胞周期，标准程序用FACS(Becton-Dickinson，USA)检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光，资料经ModFitL T 软件分析。

1.5不同TNM分期浸润性乳腺癌SGK3的表达 组织芯片(BR1503d)浸润性导管癌60例，共计120点，T1级 8点、T2级82点(T2N0 50点，T2N1 20点，T2N2 12点)、T3级16点、T4级14点，免疫组化方法进行检测，光镜下SGK3表达阳性细胞为棕黄色，Imagepro-PLus软件测定IOD值、分析同一类型、不同TNM分级乳腺癌中SGK3的表达情况。

1.6SGK3在孕激素受体(PR)-和PR+乳腺癌组织中的表达 组织芯片样本浸润性导管癌组织中PR+30点，PR-89点，免疫组化方法检测组织中SGK3表达，用Imagepro-PLus软件测定IOD值、分析PR-与PR+的乳腺癌组织中SGK3的表达情况。

1.7统计学分析 应用SPSS19.0软件进行t检验、LSD、Dunnettt检验。

2 结 果

2.1MDA-MB-231细胞迁移 MDA-MB-231亲本细胞和转染空载体细胞在划痕12 h后创伤口变化与0 h差异不大，迁移速度缓慢，但此时，转染pEGFP-N1-SGK3细胞伤口部分愈合；在划痕后24 h，前两组细胞伤口尚未愈合，转染pEGFP-N1-SGK3细胞伤口已经基本愈合，可见SGK3表达促进细胞运动侵袭(P<0.05)，见图1和表1。

图1 划痕后不同时间点SGK3过表达对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响(×40)

表1 各组划痕后不同时间点细胞迁移能力比较

与MDA-MB-231比较：1)P<0.05，与pEGFP-N1比较：2)P<0.05，表2同

2.2细胞周期 各组细胞在细胞周期G1、G2、S期的比例大致相近，无明显差异；但SGK3过表达的MDA-MB-231细胞凋亡比例却明显减少(P<0.01)，表明SGK3的表达能够抑制MDA-MB-231细胞凋亡，见表2和图2。

表2 各组细胞周期和凋亡比较

2.3不同TNM分级浸润性乳腺癌SGK3的表达 T1～T4的浸润性乳腺癌中SGK3的表达(315.11±54.31、354.56±10.85、281.74±88.11、334.51±84.88)差异无统计学意义，进而针对同一T级不同淋巴转移情况(N0～N2)的浸润性乳腺癌组织SGK3表达(T2N0 375.11±117.11、T2N1 295.36±123.94、T2N2 306.12±106.08)亦无明显差异(图3)。

图2 SGK3过表达对MDA-MB-231细胞周期、凋亡的影响

图3 不同TNM分级浸润性乳腺癌SGK3表达(×40)

2.4SGK3在PR-和PR+乳腺癌组织中的表达 PR+的浸润性导管癌组织中SGK3表达与PR-组织(340.07±127.12、336.45±104.32)差异无统计学意义(图4)。

图4 SGK3在PR-和PR+乳腺癌组织中的表达(免疫组化，×40)

3 讨 论

SGK3可以作为肝癌治疗的靶点及预后标志物〔10〕，课题组近年来对SGK3与乳腺癌的相关性研究证实：SGK3过表达会影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为，且SGK3在浸润性乳腺癌中的表达较正常乳腺组织增高、与ER等临床病理特征相关〔11，12〕，那么SGK3可否作为乳腺癌分子诊断和治疗的指标或靶点呢？本研究结果提示：SGK3过表达可促进MDA-MB-231细胞的迁移能力、抑制其凋亡，但未发现SGK3与TNM分级、PR密切相关。

SGK3 基因沉默与有效抑制乳腺癌的恶性生物学行为、SGK3在乳腺癌中的表达与P53、Ki67等影响乳腺癌发生、发展、预后的临床病理特征是否相关等要进一步研究以确定和证实SGK3在乳腺癌诊断及靶向治疗中的价值。