褪黑素对大鼠乳腺癌肿瘤生长的影响

黄玉钿 陈义忠 郑 曦 薛玉钦 吴 进

(福建医科大学附属福州市第一医院病理科，福建 福州 350009)

乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率在我国许多地区呈上升趋势，严重威胁女性健康，乳腺癌发生发展的因素机制尚未完全明确，有研究表明机体内的神经内分泌器官松果体分泌的褪黑素(MLT)不仅具有抗氧化、调节内分泌、调控机体免疫等生理功能，其异常分泌与恶性肿瘤的发生发展也有密切关系〔1，2〕。有关调节MLT分泌能否影响乳腺癌进展过程的研究，有利于加深乳腺癌与内分泌关系的认识。本研究通过建立大鼠乳腺癌荷瘤模型，分析MLT与乳腺癌肿瘤体积、癌细胞核分裂指数、Ki67增殖指数等肿瘤生长指标的关系，探讨MLT对乳腺癌细胞增殖水平、肿瘤生长程度的影响。

1 材料与方法

1.1动物选用和分组 选用清洁级SD雌性大鼠120只，2月龄，体重(200±10)g，标准颗粒饲料喂养，自由摄食饮水，于光照环境与黑暗环境下各12 h/d。随机平均分成荷瘤对照组(G组)、荷瘤+生理盐水组(M0组)、荷瘤+7.5 mg·kg-1·d-1MLT组(M1组)、荷瘤+15 mg·kg-1·d-1MLT组(M2组)。

1.2建立大鼠乳腺癌荷瘤模型 大鼠乳腺癌SHZ-88细胞株(购自中科院上海生命科学院)传代培养，SHZ-88乳腺癌细胞株于25 cm3的培养瓶中贴壁生长，培养基为RPMI1640，含10%胎牛血清，每3天细胞密集成片时传代1次，吸去旧培养基，加磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤贴壁细胞2次，用0.25%胰酶消化1 min，倒置显微镜下观察胞质缩小、贴壁细胞分离时吸去胰酶消化液，加入新培养基并吹打细胞使其脱壁，混匀后形成细胞悬液，分装转移至新培养瓶中传代，加5 ml新培养基至每个培养瓶中，混匀后置入37℃含5%CO2的培养箱，传代细胞于2 h后开始贴壁生长。取对数生长期细胞，制作SHZ-88大鼠乳腺癌单细胞悬液，按5×105个细胞/只大鼠对所有实验大鼠接种细胞悬液1次，接种部位为大鼠大腿内侧近腹股沟处皮下；从接种当日起，每日18∶00按照M0、M1、M2各组补充方案，行腹腔注射生理盐水或MLT(美国Sigma-Aldrich公司产品)1次，连续注射9 d；接种后第10天荷瘤模型建立成功，接种处可触及皮下肿块形成。

1.3测量乳腺癌肿瘤体积 大鼠乳腺癌细胞接种后第10天，处死所有荷瘤大鼠，紧贴瘤体完整剥除乳腺癌组织，离体后测量肿瘤(图1)，得到肿瘤最长径(length)及与最长径垂直的最大短径(width)数值，肿瘤体积(cm3)=length×width2/2。

图1 大鼠乳腺癌肿瘤体积、细胞核分裂象、Ki67表达

1.4苏木精-伊红(HE)染色法 大鼠乳腺癌组织经4%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，组织包埋块以5 μm厚度连续切片，采用HE染色法处理组织切片。HE染色步骤：切片经二甲苯脱蜡，通过梯度乙醇至水化后，苏木精液染色8 min，流水冲洗1 min，1%盐酸-乙醇分化1 s，稍水洗后返蓝，再流水冲洗2 min，0.5%伊红液染色1 min，稍水洗后梯度乙醇脱水干燥，中性树脂封片。显微镜下寻找大鼠乳腺癌组织切片中癌细胞的核分裂象(图1)，随机计数30个高倍视野(HPF，×400倍)中乳腺癌细胞核分裂总数，换算成平均每10个HPF的核分裂数，作为大鼠乳腺癌细胞核分裂指数(个/10HPF)。

1.5免疫组织化学法 大鼠乳腺癌石蜡包埋组织切片采用免疫组织化学Elivision二步法检测切片中Ki67表达，Ki67抗体为兔抗大鼠多克隆抗体(购自美国Bio-Techne公司，工作液浓度为1∶100)，免疫组织化学Elivision试剂盒购自福州迈新公司。检测步骤：石蜡包埋组织切片(5 μm厚度)，切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，柠檬酸高压抗原修复，待冷却后加PBS漂洗3次，每次3 min，滴加3%过氧化氢室温下反应10 min，消除内源性过氧化物酶，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加Ki67一抗，室温下孵育60 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min，PBS漂洗3次，每次3 min，滴加新配置的二氨基联苯胺(DAB)染色剂，置于显微镜下观察控制显色时间，着色后蒸馏水冲洗以结束DAB染色，苏木精衬染，流水冲洗，梯度乙醇脱水干燥后中性树脂封片。同时检测已知阳性切片以设立阳性对照，并采用PBS代替一抗作为阴性对照。Ki67阳性表达于大鼠乳腺癌细胞核上(图1)，呈棕黄色，显微镜下观察每张检测切片中热点区内5个高倍视野，计算每个高倍视野中Ki67阳性乳腺癌细胞数量/乳腺癌细胞总数的比例(%)，取平均值代表大鼠乳腺癌细胞Ki67增殖指数(%)。

1.6统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1G组与M0组乳腺癌肿瘤生长指标比较 G组乳腺癌肿瘤体积与M0组差异无统计学意义(P>0.05)。G组乳腺癌细胞核分裂指数与M0组差异无统计学意义(P>0.05)。G组乳腺癌Ki67增殖指数及M0组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组乳腺癌肿瘤体积比较 M1组、M2组乳腺癌肿瘤体积与G组和M0组比较均显著缩小(P<0.05)。M1组与M2组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3各组乳腺癌细胞核分裂指数比较 M1组、M2组乳腺癌细胞核分裂指数与G组和M0组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。M1组与M2组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4各组乳腺癌Ki67增殖指数比较 M1组、M2组乳腺癌Ki67增殖指数与G组和M0组比较均显著减小(P<0.05)，M2组明显低于M1组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组乳腺癌肿瘤体积、细胞核分裂指数、Ki67增殖指数比较

与G组比较：1)P<0.05；与M0组比较：2)P<0.05；与M1组比较：3)P<0.05

3 讨 论

MLT化学名称是N-乙酰-5-甲氧色胺，是一种吲哚类激素，最早于1959年在牛的松果体中被发现，由于青蛙摄食后会出现蛙皮褪色，故将此激素命名为MLT。机体内的MLT主要由松果体分泌，具有显著的昼夜节律性，分泌量峰值出现在夜晚，但夜间的光线照射能使血清MLT的峰值下降甚至分泌完全受抑制〔3〕。流行病学研究发现，长期夜班工作的女性患乳腺癌的风险明显高于盲人妇女，夜晚工作环境的光线照射使MLT分泌的昼夜生理节律破坏、夜间血MLT水平降低，与血中雌激素水平上升及患乳腺癌风险的增高关系密切，在前列腺癌、结直肠癌患者中也发现存在血清MLT水平的下降，这些研究提示MLT具有抗肿瘤作用〔4，5〕。MLT的抗癌作用涉及多种途径且机制复杂，除了具有抗雌激素作用，目前研究认为还与MLT促进细胞凋亡、抗氧化、调控细胞周期及调节免疫等机制有关〔6～8〕。

Ki67是一种核蛋白，由MKI-67基因编码，与核糖体RNA转录有关，其失活使核糖体RNA合成受限，Ki67在细胞周期的多个阶段均有表达，包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和细胞分裂期(M期)，仅在细胞静止期(G0期)不表达，故可作为反映细胞增殖活跃程度的标志物，Ki67增殖指数的高低与多种恶性肿瘤分化、浸润及预后等密切相关〔9，10〕。本研究结果提示，MLT能延迟或阻留乳腺癌细胞从G0期到G1期的进程，使更多细胞处于G0期，从而下调乳腺癌细胞增殖活性和Ki67增殖指数；另外，MLT对乳腺癌细胞增殖活性的抑制作用具有剂量依赖性。Liu等〔11〕研究认为MLT能调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)的磷酸化，下调细胞周期素(cyclin)和周期素激酶(CDK)mRNA及蛋白的转录表达，引起细胞周期阻滞从而抑制细胞增殖。Del Río等〔12〕研究表明MLT还能与钙调蛋白(CaM)相结合，是CaM的内源性拮抗剂，具有阻断GaM-微管蛋白复合体生成的作用，影响细胞内微管形成，甚至改变微管蛋白的结构从而造成微管破裂，抑制肿瘤细胞的分裂增殖。此外，Moreira等〔13〕研究发现，MLT还能上调促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、凋亡相关因子配体(Fas-L)的表达，激发凋亡级联反应，诱导肿瘤细胞启动凋亡程序，进一步降低增殖活性。

细胞周期中的M期即细胞核分裂期，通过计数肿瘤细胞核分裂象得出核分裂指数，可以反映肿瘤细胞分裂增殖的活性。本研究结果提示，补充MLT对乳腺癌细胞核分裂水平无显著影响，不同于MLT对Ki67增殖指数的显著影响。由于显微镜下计数的乳腺癌细胞核分裂象处于细胞周期的M期，而Ki67阳性表达的癌细胞不仅包括M期，也包括G1、S、G2等分裂间期的癌细胞，且M期持续时间短，分裂后的细胞很快转入下一期，镜下观察到的M期癌细胞数量远小于Ki67阳性癌细胞，故核分裂指数受调控影响的敏感性低于Ki67增殖指数。为了具有直观体现干预效果的指标以分析MLT对乳腺癌肿瘤生长的影响，本研究除肿瘤细胞增殖指数、核分裂指数等肿瘤生长微观参数外，还以肿瘤体积作为宏观生长指标评估MLT对大鼠乳腺癌的影响。本研究结果从直观角度反映出补充MLT能抑制乳腺癌生长浸润的范围，与MLT对乳腺癌细胞Ki67增殖指数的影响效果基本一致，表明MLT通过影响乳腺癌细胞周期抑制癌细胞增殖活性，能最终抑制乳腺癌的肿瘤生长。Jardim-Perassi等〔14〕在人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中的研究表明，经MLT治疗后，乳腺癌肿瘤体积比无MLT治疗的对照组明显缩小；对肿瘤组织的研究表明，MLT治疗后的乳腺癌中血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2表达及肿瘤间质微血管密度均明显低于对照组，MLT抑制乳腺癌间质微血管生成，降低乳腺癌组织的血液供应和营养支持，是拮抗乳腺癌肿瘤生长，使肿瘤体积缩小的重要因素。本研究进一步增加MLT的补充剂量对肿瘤体积未见显著影响，表现在Ki67增殖指数上的剂量依赖性未能出现在肿瘤体积指标上。而Jardim-Perassi等〔14〕研究则表明增加MLT补充剂量能进一步有效降低乳腺癌肿瘤体积，但较大的MLT补充剂量却导致荷乳腺癌裸鼠出现明显的体重降低和死亡率上升。有关MLT补充剂量的研究有待继续探讨，增加MLT补充剂量对肿瘤生长是进一步抑制或是产生其他作用尚未明确，根据疗效和副作用选择合适的补充剂量是MLT治疗乳腺癌的重要研究方向。