PCR检测白斑综合征病毒（WSSV）方法在小龙虾养殖中应用探索

陈俊豪 ，丁文岭 ，方丽君 ，徐洲 ，罗春景

（1.扬州市江都区水产管理站，江苏 扬州 225200；2.扬州市江都区小纪镇神潼塔岳水产养殖场，江苏 扬州 225241；3.扬州市江都区丁沟镇农业推广中心，江苏 扬州 225235）

随着小龙虾池塘养殖和稻虾综合种养产业迅速发展，小龙虾白斑综合征病害问题也日渐突出。其病原为一种环状双链DNA病毒，能感染对虾、螯虾等各种虾类，该病毒病流行快、发病广、致死率高，对小龙虾养殖业造成了严重的经济损失。由于白斑综合征病毒类病原侵染动物体后在宿主细胞内进行复制繁殖，一般常规药物无法在不伤害宿主细胞的情况下将其消灭，故而该病毒性疾病目前尚无特效治疗药物。因此在小龙虾亲本繁殖、苗种放养及养殖环节中对病原的早期诊断和及早处理带毒动物体，及时进行预测预报，并在基层生产指导单位建立快速准确灵敏的WSSV检测方法，对科学养殖指导工作有着重要的意义，对实际养殖生产的帮助也是显而易见的。PCR检测方法是一项分子生物学技术，用于放大特定的核酸片段，具有特异性强、灵敏度高、样本纯度要求低、简便快速的特点，已广泛应用于医学和生物学实验室以及传染病病原的检测。自20世纪末，对于WSSV的PCR检测方法就已有了系统研究，可对于将WSSV的PCR检测方法引入生产实践中，为养殖户进行病害的预测预报，这在扬州地区尚属首次。近年来小龙虾白斑综合征在我国湖北、江苏、安徽等小龙虾主要养殖区域危害严重，每年的5月至6月和9月至10月，水温在20～28℃为流行高峰，一旦发病，病死率高达90%以上。笔者在2018年上半年走访了江苏省扬州市江都区两户小龙虾养殖户，皆因苗种携带了WSSV，在2017年秋后和2018年春夏期间，存塘小龙虾急剧减少，导致养殖池塘血本无归。为探索小龙虾苗种及亲本携带WSSV情况，便于从源头上开展苗种产地检疫，笔者等人利用PCR法分子检测技术对小龙虾存塘亲本、苗种、异地进购的虾苗及发病塘养殖的小龙虾进行采样检测，取得了较好的效果，现将有关方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 检测样品的选择

检测样品来源于江苏龙禾生态农业有限责任公司（地点位于扬州市江都区吴桥镇）2017年存塘小龙虾亲本、2008年存塘小龙虾繁育的苗种、泗洪某小龙虾繁育公司的苗种及江都区真武镇、邵伯镇两养殖户（以下分别简称为样品 A1、A2、B、C、D、E）。

1.2 样品规格和采集时间

样品A1为2017年存塘的小龙虾亲本，规格30g/只左右，采集时间为2018年4月9日；样品B、C为2018年繁殖的小龙虾苗，规格4～5 g/只，采集时间为4月13日；样品D为2017年存塘发病的种虾、A2为2017年存塘的小龙虾亲本，规格约30 g/只，采集时间为5月23日；样品E为2018年从外地进购的小龙苗，规格约5 g/只，采集时间为2018年6月7日。2018年5月23日前后江苏龙禾生态农业有限公司养殖的小龙虾陆续出现死亡，经检查为2017年存塘的小龙虾亲本，此时正是小龙虾白斑综合征发病高峰期，在采集样品D时，同时也在该池塘采集了样品A2，经PCR分子检测，结果为WSSV阴性。

1.3 样品处理

取活虾苗或者活大虾的鳃部，放在95%酒精中（可在常温下保存30 d）或-20℃保存。如果用样品95%酒精保存，处理前必须让酒精完全挥发。充分研磨至粉末状，无明显颗粒。

1.4 DNA抽提

取 2～25 mg组织研磨物，加入 180μL GL Buffer，加入20μL蛋白酶K，10μL RNase A 混匀，56℃温浴2～3 h，可适当延长时间，12 000 r/min离心2 min离心除杂质；加入200μL GB buffer，200μL无水乙醇，充分混匀，将溶液加入收集柱小管Spin Column中，12 000 r/min离心2 min，去离心液；加入 500 μL WA Buffer，10 000 r/min离心 1 min，去离心液；加入700μL WB Buffer，10 000 rpm离心1 min，去离心液。重复1次以上步骤。再10 000 rpm离心2 min，把小柱加入新的1.5 mL离心管中，加入50～200μL Elution Buffer到小柱中央，静置5 min，65 ℃ 温浴 5 min，12 000 r/min，2 min 离心洗脱，可重复洗脱1次。

1.5 PCR

短时离心，按PCR仪WSV程序扩增DNA：94℃，4 min、94 ℃，1 min、55 ℃，1 min、72 ℃、2 min，30 个循环，72℃，10 min。4℃保温，扩增1 447 bp片段。

1.6 琼脂糖核酸电泳

倒平板：用TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mL核酸染料）凝胶，厚0.5 cm；将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液刚好淹没胶面；加样：6μL（用MIX混合液）样品加入样品孔；电泳：根据电泳槽长度，5 V/cm电泳约30 min停止；紫外光下观察核酸带，并记录结果。

1.7 nested-PCR

当PCR结果为阴性（即电泳无带）时，PCR产物可直接当模板使用。当PCR为阳性时，PCR产物要根据DNA带的强弱用水稀释10～1 000倍后才能作为nested-PCR的模板；短时离心，按PCR仪WSV 程序扩增 DNA：94 ℃，4 min、94 ℃，1 min、55℃，1 min、72 ℃、2 min，30 个循环，72 ℃，10 min。4℃保温，扩增941 bp片段。

1.8 琼脂糖核酸电泳

倒平板：用TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mL核酸染料）凝胶，厚0.5 cm；将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液（TBE,含0.5μg/mL核酸染料）刚好淹没胶面；加样：6μL（用MIX混合液）样品加入样品孔；电泳：根据电泳槽长度，5 V/cm电泳约30 min停止；紫外光下观察核酸带，并记录结果。

2 结果

图1为样品A1检测结果，采样地点：江都区吴桥镇。图1中，7号孔为阳性对照，8号孔为阴性对照，1—6号孔未出现1 447 bp大小阳性条带；15号孔为阳性对照，16号孔为阴性对照，9—14号孔未出现941 bp大小阳性条带，样品A1判断为阴性。

图1样品A1检测结果

图2 为样品B、C检测结果，采样地点：泗洪某小龙虾繁育公司、江都区吴桥镇。图2中，7号孔为阳性对照，8号孔为阴性对照，1—6号孔未出现1 447 bp大小阳性条带；15号孔为阳性对照，16号孔为阴性对照，9—14号孔未出现941 bp大小阳性条带，样品B、C均判断为阴性。

图2 样品B、C检测结果

图3 样品D、A2检测结果

图3 为样品D、A2检测结果，采样地点：江都区真武镇、江都区吴桥镇。图3中，7号孔为阳性对照，8号孔为阴性对照，1—3号孔出现1 447 bp大小阳性条带，4—6号孔未出现1 447 bp大小阳性条带；15号孔为阳性对照，16号孔为阴性对照，9—11号孔出现941 bp大小阳性条带，12—14号孔未出现941 bp阳性条带，样品D判断为阳性，样品A2判断为阴性。

图4为样品E检测结果，采样地点：江都区邵伯镇。图4中，5号孔为阳性对照，6号孔为阴性对照，2、3号孔出现1 447 bp大小阳性条带，1、4号孔为空白对照；11号孔为阳性对照，12号孔为阴性对照，8、9号孔出现 941 bp大小阳性条带，7、10号孔为空白对照，样品E判断为阳性。

图4 样品E检测结果

上列电泳照片中所使用的条带标记物均为DL2000 Marker。

第1次PCR扩增后，阳性对照会出现1条1 447 bp的DNA条带，阴性对照和空白对照没有该核酸带；

第2次PCR扩增后，阳性对照会出现1条941 bp的DNA条带，阴性对照和空白对照没有该核酸带。

因此，样品A1、A2、B、C为白斑综合征病毒（WSSV）阴性，样品D、E白斑综合征病毒（WSSV）阳性。

3 讨论

小龙虾苗种要从专业苗种繁育基地选购，要对当地小龙虾白斑综合征进行流行病学调查，避免多渠道或从小龙虾白斑综合征疫区进购苗种。笔者调查到江都区真武镇、邵伯镇两户养殖户放养的苗种，一户是2017年8月从周边不同渠道收购放养，另一户是2018年4月从湖北某地进购，发病后在短时间内存塘量急骤减少，经采样检测小龙虾均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性。

小龙虾白斑综合征发病水温一般为20～28℃，在每年4月底到6月之间暴发，而小龙虾苗种放养时多在3—4月，即便苗种或亲本自身携带WSSV，但在发病季节前，小龙虾体表无明显症状，也不发生死亡。因此，苗种放养前对存塘苗种、亲本及异地进购的苗种进行WSSV检测尤为重要。笔者等人2018年在小龙虾放养前，对存塘小龙虾亲本、苗种、异地进购的苗种进行了采样检测，检测结果均为WSSV阴性，在5月23日前后虽有小龙虾陆续死亡，但通过泼洒消毒剂、内服Vc、免疫多糖等，病情很快得到控制。而在样品A2池塘小龙虾发病死亡的小龙虾中，多数为存塘小龙虾亲本，笔者认为主要原因是存塘小龙虾亲本在虾苗孵出后，体质虚弱，蜕壳不遂或蜕壳后体质难以恢复而造成死亡。