固定化微生物制剂应用于水产养殖的研究进展

郭丽芸 ，王庆 ，姜伟 ，茆健强 ，周国勤

（1.江苏省水域生态环境微生物修复技术研究中心，南京市水产科学研究所，江苏 南京 210036；2.南京坤泰农业发展有限公司，江苏 南京 210036）

近年来集约化水产养殖在国内外迅速发展，大量饵料以鱼类代谢产物及剩饵形式进入环境，造成水体、池塘底泥等的污染[1]。养殖水域生态功能退化，病害日趋严重，给水产养殖业造成巨大经济损失。微生态制剂中的活体微生物利用有害物质实现自身生长的同时，修复退化养殖水体生态系统[2]、减少水生环境致病菌[3]、提高水产品产量和质量[4-5]，且费用低、无二次污染。随着固定化技术的深入研究，近年来，固定化高效微生物菌剂在净化养殖水体中的应用得到了广泛关注。研究固定化微生物菌剂的技术方法、寻找新型固定化材料及高效微生物菌剂，对其在养殖废水处理中的推广应用具有重要意义。

1 固定化微生物菌剂在水产养殖中的作用

微生物菌剂也叫微生态调节剂（Microecological modulator）、益生菌（probiotics）[6]。1986 年活体微生物首次用于降低爱德华菌引起的鱼类病死率，此后在水产养殖中的研究应用得到迅速发展，成为水产品养殖用药中的首选药物。但液态微生物制剂中的游离菌体极易失活[7-8]，导致很多微生物制剂产品达不到出厂时标注的活体微生物数量。而微生物制剂处理养殖废水的效果主要取决于菌种投放后活性的保留时间[9]，因此如何提高菌体存活率已成为微生物制剂的一项重要研究[10]。此外，游离微生物在池塘换水时易随水流失，需要重新添加，增加了养殖成本。

固定化技术有效解决了以上不足，将游离微生物利用化学或物理手段定位于限定空间区域，提高了细胞负荷能力[11]、处理效率[12]及生物稳定性[13]，并可反复利用，降低养殖成本。微生物被固定化后由于沉降性增加，有效减少了换水过程中的流失[14]，并相对增加了微生物在池塘底部的浓度，对底泥中有机物的分解效果大大提升。固定化微生物对不利环境如pH、温度、盐度等的耐受力比游离菌明显增强[15-16]。综上所述，固定化微生物技术具有微生物密度高、反应快、稳定性强、易于操作等优点，在养殖废水处理方面具有良好的应用前景。

2 固定化方法

固定化方法分为包埋法、吸附法、交联法和共价法。包埋法是将微生物细胞包裹于载体格子或聚合物微胶囊中[17]，阻止了微生物的泄露，同时保证基质的渗入和产物的扩散。吸附法是通过物理吸附或静电吸引将微生物细胞直接吸附在水不溶性载体上的一种固定化方法[18]，分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法通过静电、表面张力将微生物吸附在载体上，彼此之间不发生任何化学作用。离子吸附法是将微生物与载体通过离子因子或化学键吸附在一起，因此，离子吸附法较物理吸附法更为牢固。交联法是指利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使微生物发生分子间交联而被固定[19]。共价法则是通过化学试剂在微生物细胞与载体之间形成化学键而将其固定[20]。

对于固定化方法的选择，首先要求该方法操作简单、材料价廉；其次固定化后要充分保留微生物的催化活性；最后，固定化后需具备良好的物理强度、化学稳定性和基质通透性[21]。总体而言，交联法和共价法由于化学反应强烈，限制了微生物的某些活性，因此未能得到广泛应用。目前较为理想的固定化方法是包埋法和吸附法。这两种方法操作简单、对微生物活性影响小，因此在养殖水体净化处理中较为常用。

3 微生物固定化技术在水产养殖中的应用

3.1 固定化载体

理想的固定化载体要：①无毒无害、不干扰微生物功能、基质通透性好、固定化后微生物细胞密度大；②性质稳定、抗分解、机械强度高、寿命长；③固定化过程简单、成本低廉，才能够降低生产成本，在养殖废水处理过程中得到广泛应用。

海藻酸钠是目前研究应用最广的包埋载体之一[22-23]。采用海藻酸钠制备的小球稳定性强、生产成本低廉、反应条件温和，增强了微生物抗环境因子影响的能力。Lone等[24]将菌粉采用真空压缩技术放入海藻酸钠和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯（HPMCAS）微胶囊中，能有效提高菌体存活率。但也有研究认为由于海藻酸钠强度较低，易被生物分解，不利于重复利用[25]。武玉强等[26]发现海藻酸钠小球在养殖废水中极易溶解，造成水体浑浊，并为原生动物提供营养而大量繁殖，导致水体缺氧，化学需氧量、氨氮等浓度不降反升，固定化微生物净水作用难以显现。聚乙烯醇（PVA）具有机械强度大、生物毒性小、化学稳定性好、抗微生物分解、价格低廉的特点，被认为是最有效的固定化载体之一[27-29]。吴伟等[30]将PVA固定化的微生物用于养殖水体中氨氮和亚硝氮的去除，发现PVA凝胶颗粒机械强度好，经久耐用，脱氮效率明显优于游离细胞。目前微生物净化养殖水体的实验室研究多采用海藻酸钠和PVA进行固定化，但大规模制备凝胶小球还较为困难。因此，寻求价格便宜、固定化简单且适合大规模制备的新型固定化材料十分必要。

3.2 固定化菌种

固定化微生物用于养殖水体的净化必须选择合适的微生物菌种[31]。这些菌种须安全可靠、无毒无害、可快速降解有机污染物[32]，通常适合固定化的该类微生物有以下几种。

3.2.1 氮循环细菌 包括硝化菌、反硝化菌、厌氧氨氧化菌等。硝化菌生长缓慢，易受外界环境干扰，对低温异常敏感。固定化能明显提高硝化细菌耐受废水中有机质干扰能力及耐受低温的能力，可更好的去除氨氮，尤其对冬季生物处理十分有益。Kim等[33]报道固定化硝化菌对氨氮的每天最高去除率达82 g/m3。传统生物脱氮一般包括好氧硝化和厌氧反硝化两个阶段，空间上难统一。采用固定化技术后，利用固定化材料的传质性由内而外形成厌氧区、缺氧区和好氧区，实现了硝化和反硝化的统一，提高了脱氮效率[34]。厌氧氨氧化菌由于生长缓慢、生物量低，制约了其在废水脱氮中的应用。聚乙二醇（PEG）包埋固定可使其在较低温度时仍维持较高活性，从而扩大了应用范围[35]。

3.2.2 光合细菌 光合细菌是一类在厌氧条件下进行光合作用的细菌，是目前水产养殖业中应用最多的一种微生物水质调制剂[36-37]。但光合细菌菌体较小，沉降性能差，难以到达缺氧的池塘底层。固定化技术提高了光合细菌的沉降性能，净水效果稳定持久。易力等[38]采用海藻酸钠固定浓缩光合细菌用于养殖水环境的生物修复，养殖水体COD值降低54%，氨氮浓度降低80%，pH值和溶氧量显著上升，有利于养殖水环境的改善和养殖业的健康发展。

3.2.3 EM菌 20世纪90年代以来，日本比嘉照夫教授研发的有效微生物菌群（EM菌）在我国被广泛应用，为养殖水体的净化提供了新途径。该菌剂能降低养殖塘中的氨氮、亚硝氮浓度，降解有机污染物，有效改善水质，调节水体生态平衡。固定化处理增强了EM菌活性，进一步缩短了净化时间[39]。

3.2.4 其他有益菌 其他有益菌如芽孢杆菌[40-41]、假单胞菌等也可用作固定化微生物制剂。不同有益菌按一定比例制成混合菌剂后净水效果比单一菌种更佳[30]。王敏等[42]将放线菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌等混合固定化后，在大水面网箱养殖中用于水质改良，能增加溶氧、稳定水体pH、降低氨氮浓度，对水质改良效果较好。张楚等[43]选用放线菌、欧洲亚硝化单胞菌、维氏硝化杆菌、泛养副球菌和巨大芽孢杆菌与多孔钠型活化沸石颗粒吸附固定化，对河道氨氮、总磷和硫化物的去除效果明显，水质改善显著。

4 总结与展望

固定化微生物技术处理养殖废水的研究日益成熟，有利于水产养殖业建立高密度循环水养殖模式，缓解养殖生态环境的退化，适合在水产养殖中推广使用，具有广阔的发展前景。今后的研究重点主要有：①价格低廉、固定化简单、可重复利用的优质载体的开发；②固定化方法的改进；③高效微生物菌剂的筛选、培育；④与其他水体修复技术方法如高等水生植物净化法的联用。总之，随着固定化技术的不断深入研究和发展，固定化微生物在养殖废水处理中将发挥巨大潜力。