2017年北京市东城区EV-A71和CV-A16分离株VP1基因序列特征分析

王联君 李艳宇

100050北京市东城区疾病预防控制中心

1980年，手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)第1次在我国被报道。HFMD是一种由肠道病毒引起的急性传染病，病毒型别众多，优势毒株不断发生更替和改变[1]，以往的研究[2-4]显示HFMD的主要病原体为肠道病毒A组71(EVA71)和柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)。但近年一些地区研究[5-6]显示，引起HFMD的病原以非EVA71非CV-A16的其他肠道病毒为主，EV-A71和CV-A16占一定比例。自HFMD于2008年5月份被卫生部列入丙类传染病后，北京市东城区每年都进行HFMD监测。本研究通过对北京市东城区2017年分离到的EV-A71和CV-A16毒株VP1序列进行测序和进化分析，为本辖区的HFMD预防提供分子生物学资料。

1 材料与方法

1.1 样本来源 来自本辖区哨点监测医院在2017年1月1日至12月31日期间采集的HFMD疑似病例的咽拭子样本，通过Real-time PCR测定为肠道病毒通用引物阳性、EV-A71阳性或者CV-A16阳性(江苏硕世生物科技有限公司)。

1.2 病毒分离培养 将EV-A71及CV-A16核酸阳性的咽拭子按照《手足口病实验室手册》(2010版)[7]接种在人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD)细胞上，每份样本盲传2代，每代培养7 d，将产生细胞病变(CPE)的样本冻存在-80℃，备用。

1.3 EV-A71和CV-A16 VP1区的扩增及序列测定 将分离到的4株EV-A71和3株CV-A16用Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取RNA；VP1引物序列参考文献[8]设计，用TaKaRa One step RTPCR试剂盒进行RNA反转录扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，送上海伯杰生物有限公司进行测序。

1.4 同源性和系统进化分析 用DNAstar 5.0软件分别对EV-A71和CV-A16 VP1序列的核苷酸和氨基酸的同源性进行比较；用MEGA6.0进行EVA71和CV-A16的VP1序列系统进化树构建。

2 结果

2.1 HFMD病原监测及毒株分离情况 北京市东城区在2017年1月1日-12月31日期间共检测HFMD疑似病例咽拭子样本95份，肠道病毒通用引物核酸阳性46份(占48.42%)，其中EV-A71阳性4份(占4.21%)，CV-A16阳性4份(占4.21%)，非EV-A71非CV-A16其他肠道病毒阳性38份(占40.00%)。EV-A71分离出阳性毒株4株，CV-A16分离出阳性毒株3株；非EV-A71非CV-A16其他肠道病毒阳性样本上送北京市疾病预防控制中心。

2.2 EV-A71和CV-A16 VP1核苷酸和氨基酸同源性分析 4株EV-A71分离株的VP1基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比较高，分别为92.89% ～99.15%和97.32% ～98.66%；而与来自 GenBank中下载的参考毒株的序列比对，这4株EV-A71与C4a基因亚型中的VP1序列核苷酸同源性最高，达到91.87% ～96.60%，其次是C4b亚型。氨基酸同源性在不同型别之间差别不大，同源性高。3株CV-A16分离株的VP1序列核苷酸和氨基酸的同源性也比较高，分别为93.90% ～98.76%和98.32%～100.00%；而与来自GenBank中下载的参考毒株的序列比对看出，这3株CV-A16与B1b基因亚型中的VP1序列核苷酸同源性最高，达到90.91～97.62%，与A基因亚型差异较大。这些CV-A16毒株的氨基酸同源性最高达100%(见表1)。

表1 EV-A71(CV-A16)分离株与EV-A71(CV-A16)参考毒株VP1基因型或亚型的核苷酸和氨基酸同源性比较Tab.1 Comparison of nucleotide and amino acid homology of the VP1 genotype or subtype between EV-A71(CV-A16)isolated strains and EV-A71(CV-A16)reference strains

2.3 EV-A71和CV-A16 VP1种系进化树分析从图1可以看出，分离的4株EV-A71病毒与基因库中整理下载的参考株构建的种系进化树上有A、B、C、D、E等几大簇，2017年东城区分离的EV-A71都处于C4a分支，其中3株处在同一小分支上，与2010年郑州分离株(KC493671)距离较近；另株与这3株距离较远，和2014年深圳分离株(KT428644)距离较近，形成一小分支。

从图2可以看出，分离的3株CV-A16病毒株与基因库中整理下载的参考株构建的种系进化树上有A、B两大簇，B又分为 B1和B2两支，B1分为B1a、B1b、B1c三支；3株 CV-A16都属于 B1b分支上，与2014年深圳分离株(KM215267)和2013年北京分离株(KP289415)亲缘关系近，形成一小分支。

图1 2017年北京东城区EV-A71分离株与参考株VP1序列亲缘关系进化树Note:●indicates the VP1 coding region of EV-A71 strains in the studyFig.1 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of EV-A71 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

3 讨论

HFMD是一种常见传染病，多发生在低龄儿童中间。自20世纪60年代以来，其暴发和流行越来越频繁，随着时间推移和环境的改变，引起HFMD的病原谱不断发生改变，从北京市东城区2017年HFMD监测结果看出:该监测年度HFMD以非EVA71非CV-A16其他肠道病毒为主，占总检测样本的40.00%，EV-A71和CV-A16也占一定比例都为4.21%，阳性率比较低，这与李姗姗[9]等对东城区2013—2015年HFMD实验室病原学结果分析有所不同，引起这一改变的原因是由于病毒自身变异还是环境的影响有待进一步研究，在今后的监测中应进一步开展其他肠道病毒的基因分型，完善HFMD病原谱。

不同型别的肠道病毒引起的HFMD临床症状相似，但EV-A71可引起严重的神经系统损害，甚至死亡[10]，CV-A16临床症状较轻，但也可以引起严重的并发症，如孕妇自然性流产、肺部感染、无菌性脑膜炎等[11]。EV-A71和CV-A16都属于肠道病毒小RNA病毒科，由单股正链RNA组成，其编码的蛋白经水解酶最终水解形成的蛋白中，VP1蛋白不仅决定病毒的抗原性，也是作为肠道病毒属内血清分型的依据。本研究对分离阳性的4株EV-A71和3株CV-A16进行VP1基因序列测定分析，结果表明:4株EV-A71 VP1编码区核苷酸序列与从GenBank中下载的其他型别(A型U22521、B型AB059813)参考毒株核苷酸差异在15.14% ～18.78%之间，同源性较差，通过核苷酸序列比对发现主要是某些核苷酸位点发生改变，但没有出现大片段的缺失或增加。与C4a亚型代表株(2010年郑州株KC493671)序列比对中核苷酸同源性为91.87% ～96.60%，氨基酸同源性为96.31% ～98.66%，核苷酸和氨基酸同源性较高，但由于这次分析毒株数有限，EV-A71 VP1序列中核苷酸、氨基酸序列的变化是否对HFMD临床症状及其型别改变有影响需要进行长期监测分析研究。从EV-A71 VP1进化树上看出，4株EV-A71都位于位于C基因簇中的C4a亚型中，这说明2017年北京市东城区EV-A71毒株比较稳定，基因型集中，与赵曦[12]、于秋丽[13]、陈瑞珊[14]等研究一致。4株EV-A71分离株中3株聚集成一簇，与郑州株(KC493671)进化距离很近，而与另1株(BJDC-EVA71-2)距离较远，这提示东城区2017年EV-A71可能存在不同的病毒来源，能否引起不同的传播链需要进一步动态监测。有文献[15-16]将CV-A16分为A、B两个基因型，B型又分为B1和B2两个基因亚型，B1基因亚型可被进一步分为B1a、B1b和B1c亚型，本次研究的3株CV-A16 VP1编码区核苷酸序列与从GenBank中下载的其他型别(A型U05876、B2型AB465370)序列相比较，其中核苷酸位点发生多处改变，导致其核苷酸同源性较差，但也没有发生大片段的缺失和增加。这3株CV-A16与2014年深圳代表株(KM215267)核苷酸和氨基酸同源性很高，都属于 B1b型，与国内其他监测一致[8，17-18]。

图2 2017年北京东城区CV-A16分离株与参考株VP1序列种系进化树Note:●indicates the VP1 coding region of CV-A16 strains in the studyFig.2 Phylogenetic tree based on the VP1 coding region of CV-A16 and its reference strains in Dongcheng district of Beijing in 2017

由于本次研究只选取北京东城区2017监测年度年中分离的 EV-A71和CV-A16毒株进行分析，结果受到时间、地域和毒株数量的限制，绘制的亲缘进化分析结果会有一定偏倚。因此，要想准确掌握本辖区HFMD病原谱构成及病毒的变异进化特征，就需要长期监测获得更多的数据，从而为HFMD的预防控制提供基础资料。

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