辽宁省首例D8基因型麻疹病毒的分离与鉴定

王艳 郝爽 王文思 韩一楠 方兴 姚文清

110005沈阳,辽宁省疾病预防控制中心免疫规划所(王艳、郝爽、王文思、方兴、姚文清);116021大连市疾病预防控制中心免疫规划所(韩一楠)

麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的急性呼吸道传染病，临床以发热伴出疹为主要症状。2010年12月，世界卫生组织(world health organization，WHO)消除麻疹定义为:麻疹监测系统(measles surveillance system，MSS)运转良好的前提下，明确的地理区域内无本土麻疹病毒传播≥12个月[1]。因此病毒基因型的基线调查是做好麻疹消除工作的前提。近20年的监测显示辽宁省流行的麻疹野病毒基因型均为H1a[2]。2018年5月，辽宁省首次在大连1例麻疹患者的咽拭子标本中分离并鉴定出D8基因型病毒。

1 材料与方法

1.1 病例来源 该病例相关信息均来自辽宁省MSS。

1.2 标本采集、运送和初步筛查 按照全国麻疹监测方案要求，采集病例咽拭子和血标本并运送到市级麻疹实验室进行检测。血标本用ELISA法同时检测麻疹和风疹IgM抗体；提取咽拭子中的病毒核酸并使用荧光PCR法检测麻疹和风疹病毒核酸。按照辽宁省麻疹网络实验室要求，对核酸筛查阳性的咽拭子标本在10日内上送至省疾病预防控制中心分离病毒和基因分型。

1.3 病毒分离 按照《麻疹诊断》WS 296—2017附录B.1处理标本并将标本接种至单层Vero/Slam细胞，逐日观察细胞是否产生病变(CPE)。如出现麻疹病毒典型的融合CPE可连续传至3代后收获，3代后仍无CPE的视为阴性弃去。

1.4 毒株鉴定 使用RT-PCR方法对收获的毒株进行鉴定。使用Qiagen公司 One-Step RT-PCR Kit扩增MV H基因全长和N基因羧基末端的676个核苷酸。实验条件及引物序列参照文献[3]。

1.5 序列分析 将PCR产物送北京Invitrogen生物技术有限公司测序。将返回序列与WHO MV 24个基因型的参考株序列，使用MEGA 5.0软件分别对H基因和N基进行核苷酸和氨基酸的变异比对分析，并构建基因亲缘关系进化树。

2 结 果

2.1 病例的流行病学 病例为男性，1983年出生，大连市户籍，待业。2018年4月30日出现发热和呼吸道卡他症状，5月1日出现皮疹，临床诊断为麻疹并进行网络直报。患者不清楚是否接种过麻疹疫苗，发热前7～21 d无外出史，无医院就诊史，与明确感染出疹性疾病患者无接触史。

2.2 血清麻疹、风疹IgM抗体检测和咽拭子核酸检测 麻疹IgM抗体和病毒核酸均为阳性，风疹IgM抗体和病毒核酸均为阴性。该病例为麻疹实验室确诊病例。

2.3 病毒分离、复核和标准命名 接种咽拭标本的细胞于第一代就出现了典型的融合病变，转种至3代后收获病毒。该病毒序列经国家麻疹参比实验室复核并确认为D8基因型。按照WHO麻疹野病毒的标准命名方法，将该麻疹病毒分离株命名为:MVi/Liaoning.CHN/18.18/1。

2.4 D8基因型确定 将辽宁省D8基因型麻疹病毒与WHO 24个基因型参考株、GenBank上下载的北京、香港的D8基因型麻疹病毒流行株和2017—2018年麻疹病毒D8基因型其他国家流行株基于N基因羧基端450个核苷酸序列构建基因亲缘关系进化树(图1)。MVi/Liaoning.CHN/18.18/1麻疹野病毒与WHO D8基因型麻疹病毒参考株MVi/Manchester.GBR/30.94/D8最为接近，其 Bootstrap值为98.9%。该分离株属于D8基因型。

2.5 辽宁D8基因型麻疹病毒分离株H和N基因变异分析 辽宁株与WHO D8基因型参考株Manchester.GBR/30.94 N基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%和97.3%；H基因核苷酸和氨基酸同源性均为98.9%。与中国优势流行H1参考株Hunan.CHN/93/7 N基因核苷酸和氨基酸同源性分别为92.4%和91.3%，H基因核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%和95.8%(表1)。

3 讨 论

麻疹病毒基因型别分布具有明显的地理特征，并且野病毒流行与年代存在一定的相关性[4]。D8基因型麻疹病毒主要流行于印度、孟加拉等南亚国家，美国和澳大利亚近年来也多次监测到D8基因型的流行。中国首例输入性D8基因型麻疹病例由上海市疾病预防控制中心于2012年报道[5]。2013年在北京出现2起由D8基因型麻疹病毒感染引起的暴发疫情，2016年之后又在广东、湖北、内蒙古、云南和安徽等省出现D8病毒的传播(GenBank上未获得相应序列资料)。经分析辽宁省此次D8基因型病毒与GenBank上传的中国香港2012—2016年流行序列100%同源，与2018年在哥伦比亚分离的MVi/LosPatios.COL/11.18/D8序列同源性为100%。与2013年北京流行的D8基因型麻疹病毒处于不同的分支。

图1 辽宁省D8基因型麻疹病毒分离株与WHO各基因型参考株构建的基因亲缘性关系树D8 genotype strains of China；2017-2018 D8 genotype strains from other countries；WHO D8 genotype strain；Liaoning isolateFig.1 The phylogenetic tree of Liaoning D8 strains compared to the WHO reference strains for each genotype

自患者确诊为麻疹后经过1个麻疹最长的潜伏期，未发现2代病例，大连麻疹疫情平稳。H基因变异分析显示，该D8麻疹病毒分离株与疫苗株S191相比在重要抗原位点变异程度与辽宁H1分离株相似，结合流行病学信息表明通过疫苗接种或者自然感染本土H1a基因型麻疹病毒后，体内产生的抗体对阻断D8基因型病毒的扩散和传播起一定作用。

辽宁D8基因型毒株与2016年于安徽和上海流行的D8基因型麻疹病毒同源性均为100%(国家麻疹实验室未发表数据)，因此推测D8基因型有可能已经在我国呈现小范围流行，该推测还需要综合分析全国麻疹病毒学监测数据进行进一步研究加以证实。随着我国本土H1基因型麻疹病毒传播的减少，非本土基因型麻疹野病毒的输入就会凸显，越来越多的病毒基因型输入引起的病例就会被监测到。需要加强流行病学和实验室监测，密切追踪D8基因型麻疹病毒在我国的流行态势，以便采取有效措施及时阻断该病毒在我国的进一步转播。

表1 辽宁省D8基因型麻疹病毒分离株与24个WHO不同基因型参考株N和HN基因平均遗传距离Tab.1 N and H mean p-distances for nucleotides and amino acids for measles viruses D8 isolated of Liaoning province with WHO 24 genotype representative strains

利益冲突 无