IL-2、IL-2Rα 及 IFN-γ 基因多态性与汉族儿童支气管哮喘的关联

郑绪阳 陈岳明 刘占利 汤慧芳 黄先玫 杨一华 盛文彬

支气管哮喘是儿童常见的变态反应性疾病，严重影响儿童的身心健康。全球范围内哮喘发病日益增高，目前约有3.34亿人罹病[1]，2010年我国儿童哮喘协作组调查显示我国城区0～14岁儿童哮喘总患病率为3.02%（95%CI:2.97% ～3.06%）[2-3]。Th1/Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制[4]。研究显示，中度持续性哮喘患者血清sIL-2Rα水平明显高于轻度持续性哮喘患者，而哮喘患者血清 IFN-γ 水平下降[5-7]。IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及 IFN-γ（rs2430561 T/A）基因多态性已被报道与一些Th1/Th2失衡相关疾病有关联，但与儿童支气管哮喘的发生目前还尚不明确[8-11]。因此，本研究以支气管哮喘汉族儿童为研究组，以汉族无支气管哮喘儿童作为对照组，通过分析两组儿童IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）及 IFN-γ（rs2430561）多态性位点等位基因频率、基因型分布差异，旨在明确上述多态性位点与汉族儿童支气管哮喘发生的关联。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2010年8月至2013年12月在浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院儿科急诊、门诊及住院汉族患儿。依据2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的《儿童哮喘防治常规》确诊为支气管哮喘的急性发作期儿童144例为研究组，男79例，女65例，年龄6个月～11岁，中位数3.7岁；病程2个月～7年，中位数2.4年。选择同期门、急诊及住院的228例汉族无支气管哮喘儿童为对照组，男 123例，女105例，年龄6个月～10岁，中位数3.2岁，无呼吸道及其它部位感染以及过敏反应史。两组患儿均排除并发有呼吸衰竭、心力衰竭、先天性心脏病等。两组患儿性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院医学伦理委员会审核批准，所有家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血标本收集及基因组DNA提取 所有患儿采集晨起空腹EDTA.K2抗凝静脉血2ml各2管。其中1管用于基因组DNA提取，采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按照说明书进行操作，提取的DNA样本采用紫外分光光度法（260/280比值）确定DNA的纯度，光密度（OD）260测定DNA的浓度，置-20℃冷冻备用。另1管2 000r/min离心10min后，取血浆1ml置-20℃冷冻备用。取A260/280比值为1.7~2.0的 DNA标本用于后续PCR-RFLP基因分型研究。

1.2.2 PCR-RFLP联合测序法检测单核苷酸多态性根据Genebank基因库序列信息，在IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及 IFN-γ（rs2430561 T/A）的位点设计特异性扩增引物。引物均经在线软件设计（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），由上海辉睿生物技术有限公司合成。PCR扩增体系包括：10×buffer（Mg2+free）5μl，dNTP（10mmol/L）4μl，Mg2+（25mmol/L）3μl，正向引物（10nmol/L）1μl，反向引物（10nmol/L）1μl，模板 DNA 5μl，Taq 酶（5U/μl）1μl，用去离子水补齐至50μl反应体系（大连TakaRa生物技术有限公司）。引物序列及PCR扩增条件见表1。PCR产物由上海生物工程有限公司完成，测序引物均为正向引物。基因型鉴定：取适量PCR产物行限制性内切酶消化，37℃室温育16h，终止酶切反应，产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，凝胶成像系统判定结果。对其中部分基因型的PCR扩增产物，进行胶回收、过柱纯化，送上海生工生物公司作DNA测序验证。

1.2.3 IL-2Rα mRNA相对表达量检测 按基因分型结果，随机抽取研究组中AA基因型、AG基因型标本各50份。用TRIzol（美国英维捷基）提取全血总RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas）说明书操作合成cDNA。SYBR Green I实时荧光PCR检测IL-2Rα mRNA相对表达量，PCR扩增引物分别为：正向引物5'-GGTCCCAGGCAGAGAATCAT，反向引物5'-CACCTTGTGTGTCCACCTGTA；以βactin基因作为内参照，正向引物5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'，反向引物5'-AAGGAAGGCTGGAA－GAGTGC-3'。实时荧光PCR检测试剂购自中国大连TakaRa生物技术有限公司，反应体系按说明书进行配制。PCR反应循环参数为：95℃3min后进行40个循环，包括 95℃ 10s，60℃ 34s。根据 2-ΔΔct法来计算 IL-2Rα mRNA相对表达量。

1.2.4 血浆sIL-2Rα水平检测 上述研究组中AA基因型、AG基因型标本各50份标本对应的血浆sIL-2Rα水平检测采用ELISA法（美国Creative Diagnostics）。该试剂检测线性范围31.25~2 000 pg/ml，检测下限为16 pg/ml。实验操作严格按说明书进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件。Hardy-Weinberg遗传平衡定律吻合度检验、病例与对照组基因型和等位基因频率分布比较均采用χ2检验；关联分析采用95%可信区间（CI）的比值比（OR）表示。对照组不同基因型个体组间IL-2Rα mRNA相对表达量及血浆sIL-2Rα水平采用Mann-Whitney检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 候选基因位点等位基因频率及基因型分布 本研究中未发现IL-2（rs6822844）位点有多态性分布，其余2个位点的等位基因及基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因A在研究组分布频率（86.8%）高于对照组（79.4%）（OR=1.708，95%CI：1.113~2.629，P=0.010）；研究组中 AA 基因型患者分布频率（75.0%）高于对照组（62.3%）（OR=1.745，95%CI：1.058~2.884，P=0.021）。IFN-γ（rs2430561）位点等位基因及基因型频率在两组中分布差异均无统计学意义（P=0.182、0.205、0.421），详见表 2。

表2 3个候选基因位点等位基因频率及基因型分布[例（%）]

图1 IL-2Rα（rs2104286）位点不同基因型个体外周血IL-2Rα mRNA相对表达量

2.2 IL-2RA mRNA相对表达量 经SYBR Green I实时荧光PCR检测IL-2Rα mRNA相对表达量，AA基因型携带者相对表达量（1.263±0.625）明显高于AG基因型携带者（1.044±0.436）（P=0.043），详见图 1。

2.3 血浆sIL-2Rα水平 结果显示，AA基因型个体血浆sIL-2Rα水平（157.86±67.21）明显高于AG基因型个体（126.41±58.63）（P=0.018），详见图 2。

图2 IL-2Rα（rs2104286）位点不同基因型个体血浆sIL-2Rα水平

3 讨论

研究表明，支气管哮喘是多种炎症因子引起的慢性气道炎症。Thl/Th2失衡是哮喘发病的一个重要机制[4]。IL-2和IFN-γ是Thl型细胞分泌的重要细胞因子。IL-2Rα在维持免疫系统功能方面起关键作用[5]。IL-2Rα脱落入血液后形成可溶性IL-2Rα（sIL-2Rα）。研究显示支气管哮喘患者肺泡灌洗液IL-2水平明显升高，并且中度持续性哮喘患者血清sIL-2Rα也明显高于轻度持续性哮喘患者，而哮喘患者血清IFN-γ水平下降[6-7]。细胞因子的合成受遗传因素的影响[7-10]，细胞因子的合成受遗传因素的影响，Th2细胞产生的IL-4、IL-13等细胞因子基因多态性与哮喘发生有明显关联，如Li等[7]通过病例对照研究显示IL-4-589 C/T多态性与哮喘易感性有关联；Braddock 等[8]发现 IL-13 Arg130Gln（rs20541）和G（rs1295685）基因多态性与哮喘易感性和血清IgE水平相关。IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及IFN-γ（rs2430561 T/A）基因多态性已被报道与一些Th1/Th2失衡相关疾病有关联，但与儿童支气管哮喘的发生目前还尚不明确[11-12]。

IL-2主要由Th1细胞分泌，人IL-2基因位于4号染色体（4q27），而IFN-γ基因位于12号染色体长臂（12q24.1），这些基因编码可能会导致在相应的细胞因子的表达变化，从而导致Th1/Th2失衡。如IL-2（rs6822844）多态性与类风湿性关节炎、系统性硬化症[13-14]；支气管哮喘患者IL-2水平明显升高[6,12,15]。研究报道IL-2基因存 在 多 态 性 （rs6822844，rs6534349，rs2069762 和rs3136534），本研究纳入 IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）及 IFN-γ（rs2430561）作为候选多态性位点，结果表明，IFN-γ（rs2430561）位点与支气管哮喘发病无明显关联，并且在本研究的样本量内未发现IL-2（rs6822844）位点在中国汉族儿童有多态性分布。

IL-2R基因位于10号染色体短臂（10p15.1），IL-2受体由3个亚单位组成，包括α亚基（IL-2R；CD25），β亚基（IL-2Rβ；CD122）和 γ 亚基（γC；cd132）。IL-2Rα在维持免疫系统的功能发挥着关键性的作用，与IL-2Rβ 和 γC 亚基和细胞因子（IL-2、IL-4、IL-7，IL-9，IL-15和IL-21联合在细胞信号传导中发挥作用[5]。IL-2Rα释放到血液中的可溶性IL-2Rα形成后（sIL-2R）。在中度持续性哮喘患者，血清sIL-2Rα水平显著高于轻度持续性哮喘患者[6,12,15]。在以往的研究中，IL-2Rα（rs2104286）作为候选基因多态性与Th1/Th2疾病[16]和1型糖尿病和幼年特发性关节炎的失衡有关；然而，这些位点与支气管哮喘的关系尚未见报道，尤其是中国的孩子。

IL-2R（rs2104286）位点位于基因的第一个内含子。Struja等[17]报道称，AA基因型患者血清sIL-2R水平显著高于其他基因型（P=0.012）在对照组，但差异无统计学意义之间的基因型在甲状腺功能亢进组。本研究运用性别、年龄配对的病例对照研究，通过PCR产物测序的方法分别鉴定了144例汉族支气管哮喘患儿及228例无支气管哮喘儿童上述3个基因位点等位基因频率、基因型分布，结果发现IL-2Rα（rs2104286）位点等位基因A相对于 G是致病基因（OR=1.708，95%CI：1.113~2.629，P=0.010）；AA基因型个体患病风险高于AG基因型个体（OR=1.745，95%CI:1.058~2.884，P=0.021）。本研究还发现，在研究组中IL-2Rα（rs2104286）位点AA基因型个体外周血IL-2RA mRNA相对表达量以及血浆sIL-2Rα水平均显著高于AG基因型（P=0.043、0.018），提示rs2104286可能是IL-2Rα基因的一个功能性位点。许多自身免疫性疾病中CD25单抗在降低疾病活动性方面已显示出很好的疗效，其效应不仅直接作用于T细胞，而且作用于NK细胞和树突状细胞[18]。最近，关于哮喘患者炎症级联反应细胞因子的作用，研究人员还认为，IL-2受体拮抗剂可用于治疗哮喘[19]的新策略。

总之，本研究表明IL-2R（rs2104286）位点可能与汉族儿童支气管哮喘的发生有关，和网站可以影响哮喘的表达。结果表明，IL-2受体可能是一种潜在、有效的哮喘治疗目标，其基因型的临床意义在指导个体化用药。