miR-106b对脂多糖诱导活化的人单核巨噬细胞分泌TNF-α的影响及机制研究

陈军 周盈盈 陈黎黎 赵初环

冠状动脉粥样硬化严重危害人类健康，阐明其发病机制是当前亟待解决的重大问题[1]。目前，冠状动脉粥样硬化是一种炎症过程的论点已经被普遍认可[2-3]。其中，人单核巨噬细胞（THP1）主导的炎症反应在冠状动脉粥样硬化的发生、发展中发挥着关键的作用，但其炎症反应调节机制尚未完全阐明[4]。TNF-α是主要由人THP1分泌的促炎症细胞因子，它可以直接或间接损害血管内皮，促进血管炎症及血栓形成。研究证实，在冠状动脉粥样硬化的过程中，TNF-α起着重要作用[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来被发现参与心血管调节的一类非编码小RNA[6]，研究表明miRNA对炎症具有重要的调节作用[7]。前期我们通过miRNA基因芯片，分析对比了人THP1活化前后miRNA的表达谱变化，发现人THP1活化后miR-106b出现高表达。因此，本文拟在脂多糖（LPS）诱导人THP1炎症反应的细胞模型中，研究miR-106b对人THP1分泌TNF-α的调节作用及其可能机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 THP1由中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库提供；FBS（美国Gbico公司)；RPMI 1640培养基、Opti-MEMI培养基、脂质体2000（美国Invitrogen公司）；LPS（TLR4刺激剂，美国 Sigma公司）；miR-106b mimic、NC mimic（上海吉玛生物有限公司）；人TNF-αELISA试剂盒（美国Ebioscience公司）；miRNA逆转录及定量PCR试剂盒（美国应用生物系统有限公司）；抗SIRPα-APC荧光标记抗体（美国BD公司）。

1.2 细胞培养及刺激 将THP1细胞用1640完全培养基培养于 24孔板，LPS 1μg/ml刺激。分别于 0、6、12h 收集细胞，Trizol法抽提RNA，荧光定量PCR检测miR-106b表达量；于24h后收集细胞上清液，测上清液TNF-α表达量，另设阴性对照进行比较。

1.3 分组和miRNA转染 重新取THP1细胞，分为LPS组、NC对照组和miR-106b组3组。LPS组，THP1细胞不转染，单用 LPS（1μg/ml）刺激 24h；NC 对照组，每孔细胞中加入NC mimic（与靶基因序列不相符）100nmol转染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h；miR-106b 组，每孔细胞中加入miR-106b mimic 100nmol转染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h。实验严格按照 Invitrogen公司Lipofectamin2000说明进行操作:（1）miRNA和Lipofectamin2000（1μl/孔）分别溶于 50μl的 opti-MEM 无血清培液中5min，混匀；（2）将上述两者等体积混匀15 min；（3）将上述混合液按照每孔 100μl加入细胞中；（4）培养4h后，更换为完全培养基，加入1μg/ml的LPS刺激24h，然后收集细胞进行后续实验。LPS(1μg/ml)刺激24h后，检测各组THP1细胞上清液TNF-α的表达量。

1.4 miRNA靶蛋白预测 为进一步明确miR-106b在THP1细胞分泌TNF-α异常的通路中可能的作用机制，我们采用在线预测靶点工具Targetscan version5.1生物信息学分析系统初步预测其可能的靶蛋白以及它们可能的作用位点，预测miR-106b可能调控的靶基因。

1.5 流式细胞仪检测样本细胞靶蛋白表达量 每个样本均准备两份，每份1×105个细胞，约20~30μl体积。LPS组、NC对照组、miR-106b组均加入0.3μl用APC标记的抗SIRPα抗体染色；另设阴性对照组（neg组，不染色），4℃孵育30min左右。用1ml加有0.2%FBS的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤上述反应混合液，1 700r/min离心5min，重复上述步骤1次。然后用200μlPBS悬浮细胞，流式细胞仪上机检测。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料均以表示，两组间均数比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验,方差不齐者采用 Tamhane′sT2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。作图采用GraphPad Prism 6软件。

2 结果

2.1 LPS刺激 0、6、12h后 THP1细胞 miR-106b的表达水平比较 见图1。

图1 LPS刺激0、6、12h后THP1细胞miR-106b的表达水平比较

由图 1可见，LPS刺激 6、12h后 THP1细胞miR-106b表达水平均明显升高（均P＜0.01），且6h时＞12h时（均P＜0.01）。

2.2 LPS刺激24h后THP1细胞上清液TNF-α表达水平比较 见图2。

图2 LPS（1μg/ml）刺激 24h后THP1细胞上清液TNF-α表达水平比较（**P＜0.01）

由图 2 可见，LPS（1μg/ml） 刺激 24h 后，LPS 组THP1细胞上清液TNF-α表达水平与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），提示采用TLR4刺激剂LPS活化THP1细胞的体系构建成功。

图3 3组细胞上清液TNF-α表达水平比较（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 3组细胞上清液TNF-α表达水平比较 见图3。

由图3可见，与LPS组和NC对照组比较，miR-106b组THP1上清TNF-α表达水平明显增多（均P＜0.05）；NC对照组与LPS组相比无统计学差异（P＞0.05）。

2.4 生物信息学预测miR-106b作用靶蛋白 经Targetscan Version 5.1生物信息学分析系统初步预测，其可能的靶蛋白为信号调节蛋白α（SIRPα），它们可能的作用位点见图4。

图4 miR-106b作用靶蛋白及作用位点预测（矩形图为miR-106b靶基因SIRPα mRNA结构图，miR-106b可与 SIRPα5'UTR区结合而发挥调控作用，target site为miR-106b作用于SIRPα时的结合位点GCACUUU）

2.5 流式细胞仪检测各组THP1细胞SIRPα表达水平 见图5。

图5 检测各组THP1细胞SIRPα表达水平的流式细胞图

由图5可见，与NC对照组和LPS组比较，miR-106b组的THP1细胞SIRPα表达水平明显下降（均P＜0.05）。

3 讨论

本研究通过体外脂质体转染过表达miR-106b等方法，发现该miRNA可促进人THP1分泌TNF-α。为进一步明确miR-106b在THP1分泌TNF-α异常的通路中可能的作用机制，采用生物信息学分析初步预测其可能的靶蛋白为SIRPα，并采用流式细胞仪检测证实miR-106b可通过抑制靶蛋白SIRPα表达，进而促进THP1细胞活化后分泌TNF-α的量。miRNA是近年发现的一类长约19～22个碱基的单链非编码小分子RNA。研究显示，miRNA是一类重要的负调控因子。成熟的miRNA通过核酸序列互补结合到靶mRNA非编码区来抑制翻译或促进靶mRNA的降解，从而起到负调节作用，其在固有免疫，适应性免疫及炎症因子的信号转导过程中都起着重要作用[8-9]。

已有研究显示，miRNA参与调控心血管疾病的发病过程。研究证实，miRNA可以通过细胞和分子水平来改变靶基因的表达，进而参与调控心血管相关的一些重要生物学过程，包括血管的形成、细胞的分化和增殖以及凋亡等[10]。同时，研究表明，miRNA也可调控心血管疾病相关炎症因子的表达。Zhu等[7]研究发现，miR-155可以通过抑制氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的巨噬细胞表达TNF-α、IL-6等炎症因子，进而抑制动脉粥样硬化的发生和发展。Sun等[11]研究发现，体内过表达miR-181b可以抑制载脂蛋白E敲除（apolipoprotein-E deficiency，ApoE-/-）小鼠体内 TNF-α、IL-1β 等促炎症因子的表达，抑制小鼠动脉粥样斑块的形成。目前对miR-106b的功能研究主要集中在肿瘤免疫方面。miR-106b可以通过作用于肿瘤抑制基因 RBL1、RBL2、CASP8增加胶质瘤的发生率[12]。而其过表达可以通过激活上皮-间质转变促进肝癌细胞的迁移和转移[13]。近年来，Tang等[14]研究发现，miR-106b还可以对树突状细胞起调控作用。miR-106b可以抑制卵清蛋白诱导的树突状细胞的促过敏及随后的Th2细胞的极化，对过敏性炎症性疾病具有治疗作用。而树突状细胞已被证实在动脉粥样硬化过程中起着重要作用。在ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型中，浆细胞样树突状细胞起到关键的促动脉粥样硬化作用，而通过清除小鼠体内浆细胞样树突状细胞，可以明显减少动脉粥样硬化斑块的形成[15]。目前尚无关于miR-106b对动脉粥样硬化或巨噬细胞炎症直接调控作用的相关研究。

此外，本研究通过生物信息学分析技术预测miR-106b可能的潜在靶基因为SIRPα，并通过流式细胞检测进一步从蛋白水平证实了miR-106b可以抑制THP1细胞膜表面蛋白SIRPα的表达。SIRPα是属于免疫球蛋白超家族的I型跨膜受体，可表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞胞、树突状细胞、内皮细胞等胞膜上[16]。研究发现，SIRPα与其配体CD47作用可以抑制巨噬细胞的吞噬作用[17]。CD47融合性蛋白可以通过作用于CD172a+（SIRPα）细胞抑制克罗恩病模型小鼠IL-1β和TNF的分泌[18]。因此，SIRPα在巨噬细胞以及其炎症反应中发挥了重要作用。研究显示，巨噬细胞及其炎症反应在动脉粥样硬化形成过程中扮演着重要角色。巨噬细胞可通过分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），募集单核细胞和更多的巨噬细胞到血管壁，导致动脉粥样硬形成[19]。Liu等[20]发现，SIRPα可以抑制β2整合素介导的人THP1的黏附、迁移和吞噬作用，进而可能抑制动脉粥样硬化早期血管壁上的人THP1过度激活与聚集。

本研究通过采用体外LPS诱导活化人THP1细胞，发现活化的THP1细胞可分泌大量TNF-α。体外过表达miR-106b后，其可促进THP1细胞分泌TNF-α。本研究阐明了miR-106b在人THP1分泌TNF-α过程中的作用，拓宽了对miRNA在调控巨噬细胞炎症网络的了解，有助于进一步了解动脉粥样硬化相关疾病，特别是冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制，并为此类疾病的分子靶向治疗提供理论依据。