组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK—228诱导人舌癌细胞的凋亡研究

赵晶

[摘要] 目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK-228对Tca-8113细胞增殖、凋亡机制。 方法 低糖DMEM培养Tca-8113；倒置显微镜观察Tca-8113细胞受FK228的作用；在不同药物浓度处理24 h、48 h、72 h后利用CCK-8检测Tca-8113细胞增殖情况；Tca-8113凋亡细胞利用DNA ladde试剂盒检测。 结果 0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228对Tca-8113处理24 h、48 h、72 h后均有抑制作用，且与剂量、作用时间呈正相关。经FK228药物处理48 h后的细胞有DND LDEER出现。 结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK-228可呈降低人口腔鳞癌Tca-8113细胞活性，抑制其细胞增殖，诱导细胞凋亡。

[关键词] CCK-8；细胞凋亡；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；FK-228

[中图分类号] R739.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）20-0044-03

Study on histone deacetylase inhibitor FK-228 in the induction of apoptosis of human tongue carcinoma cells

ZHAO Jing

Department of Stomatology， Fushun Mining Bureau General Hospital， Fushun 131000， China

[Objective] Abstract To investigate the mechanism of proliferation and apoptosis of Tca-8113 cells by histone deacetylase inhibitor FK-228. Methods Tca-8113 was cultured by low glucose DMEM； the effect of FK228 on Tca-8113 cells was observed by inverted microscope； the proliferation of Tca-8113 cells was detected by CCK-8 at 24h， 48h and 72h after being treated by different drug concentrations. Tca-8113 apoptotic cells were detected by DNA ladde kit. Results After Tca-8113 was treated for 24 h， 48 h and 72 by 0.1 μg/mL， 2 μg/mL and 4 μg/mL FK-228， all showed an inhibitory effect， which was positively correlated with the dose and the time of effect. There were DND LDEER appeared in cells treated with FK228 for 48 hours. Conclusion The histone deacetylase inhibitor FK-228 reduces the activity of human oral squamous carcinoma Tca-8113 cells， inhibits cell proliferation and induces apoptosis.

[Key words] CCK-8； Apoptosis； Histone deacetylase inhibitor； FK-228

口腔癌的發病率居全身恶性肿瘤的第六位，目前已是最常见的恶性肿瘤。口腔恶性肿瘤治疗不理想[1]，口腔鳞癌是头颈部常见恶性肿瘤，在我国其发病率占头颈部恶性肿瘤的40%，而5年生存率仅40%～50%[2]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACis）抑制（包括组蛋白）残留的赖氨酸蛋白的脱乙酰化，并调节各种基因的转录。近年来，已被临床用作抗癌药物和可能的抗糖尿病药物，但有证据表明高剂量的HDACis是有细胞毒性的[3-4]。针对组蛋白去乙酰化酶在癌症细胞中缺少调节这一弱点可作为治疗肿瘤细胞的新靶点[5]。本实验研究不同浓度的FK-228作用于口腔鳞癌Tca-8113后观察细胞增殖、凋亡，讨论组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人舌癌鳞状细胞Tca-8113由上海交通大学赠予。FK-228采购自美国MCE公司，DMEM、胎牛血清采购自Gibco公司，PBS液由哈尔滨兽医研究所提供，CCK-8试剂盒由日本同仁采购，琼脂糖凝胶由哈尔滨兽医研究所提供，DNA Ladder凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞组织学培养及细胞观察形态 Tca-8113细胞复苏后培养，待细胞贴壁生长旺盛时取3×105/孔接种于96孔板中，37℃ CO2温箱中培养，待细胞贴壁后更换低糖DMEM培养液，实验整体过程注意无菌操作，设立实验组与空白对照组。24 h、48 h、72 h后在倒置相差显微镜下观察药物浓度为0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL后细胞形态变化。

1.2.2 细胞增殖检测 通过CCK-8法检测细胞抑制率：将对数生长的Tca-8113细胞3×105/孔置于96孔板中，24 h后更换培养液：①空白孔（培养液）；②对照组（不加药）；③实验组，加入终浓度为0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228。均设5个复孔。24 h、48 h、72 h后每孔滴入10 μL CCK-8液，避光放置。设定酶标仪读数为450 nm，检测96孔板内的吸光度值（A），重复实验4次。收集数据计算细胞抑制率。

1.2.3 DNA Ladder試剂盒检测凋亡 选择生长旺盛Tac-8113细胞，使细胞浓度为3×105个/mL置于25 cm2细胞瓶中，待细胞贴壁后，设立对照组（不加药）及实验组，选择实验组药物浓度为2.0 μg/mL。作用48 h后，离心收集2×106个细胞置于1.5 mL Eppendorf管中，PBS液轻轻清洗，将沉淀物中滴入Lysis Buffer 100 μL，实验过程避光操作，10 s震荡离心保留上清液，按说明书进行以下操作：滴入20 μL SolutionA、EnzymeA，轻轻摇匀在55℃恒温1 h，加入EnzymeB 20 μL，37℃恒温水域置1 h，滴入Precipitant 130 μL、冰乙醇950 μL，-20℃处理12 h后收集DNA，DNA用70%冷乙醇洗并干燥10 min，滴入TE Buffer 10 μL、Loading Buffer 2 μL，配置1.5%琼脂糖凝胶，每孔加入20 μL试验样品，5 V/cm下电泳3 h，在紫外灯下观察收集照片。

1.3 统计学方法

统计软件SPSS17.0进行数据学分析，本实验数据为计数资料，细胞抑制率采用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FK-228对Tca-8113细胞形态的观察

在倒置显微镜下，未经药物处理的舌癌Tca-8113细胞形态为多边形，贴壁排列整齐规整，细胞有光泽。增加FK-228药物浓度、延长FK-228药物作用Tca-8113细胞时间，细胞外形开始变圆、体积缩小，透光度减低，药物作用时间越长培养液中变形细胞漂浮越多，细胞颜色暗淡。而对照组中细胞贴壁生长良好，培养中漂浮细胞较少。

2.2 FK-228对Tca-8113细胞增殖的影响

与对照组比较，经FK-228处理后的细胞数量及吸光度值随着药物浓度增加减少，与药物剂量相关。随着药物作用时间延长，细胞存活率逐渐减低见封三图7。通过χ2检验，24 h与48 h相比，χ2=4.06，P>0.05。24 h与48 h各浓度比较，χ2=11.314，P<0.05，48 h与72 h相比，χ2=2.196，P>0.05。48 h的抑制率分别为21.6%、38.72%、47.9%，72 h时培养液中有大量坏死细胞干扰抑制率所以不采取数据结果。

2.3 DNA Ladder检测细胞凋亡

药物浓度为2.0 μg/mL FK-228处理Tca-8113细胞48 h后细胞有凋亡发生。见封三图8。

3 讨论

组蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）是一种氨基水解酶，组蛋白去乙酰化赖氨酸残基，用于染色质重塑，因此在基因表达的表观遗传调控中起着至关重要的作用。由于其异常的活性和在多种癌症中的过度表达，HDAC被认为是潜在的抗癌药物靶点。HDACis对细胞毒性作用体现在正在增殖、己经停止生长的恶性肿瘤细胞，而对诱导正常细胞死亡的剂量是恶性肿瘤细胞10倍或更多[5]。HDACis调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态，组蛋白和非组蛋白是细胞表观遗传修饰的关键分子，HDACis通过修复DNA、抑制细胞周期、诱导凋亡和改变基因表达来有效地抑制增殖。目前根据其化学结构不同可分为六类：（1）短脂肪酸类如丁酸钠；（2）亲电子酮类如三氟甲基酮；（3）异羟基肟酸如SAHA；（4）环四肽类如FK-228；（5）苯甲酰胺类如MGCD0103；（6）其他类[6]。到目前为止，有四种药物，即SAHA、FK-228、PXD-101、LBH-589已经获得FDA的癌症批准，部分HDACis目前正处于临床试验的不同阶段[7-8]。SAHA和FK-228被批准用于第二线治疗难治、持久或复发的皮肤T细胞淋巴瘤。基于使用HDACis的抗癌治疗的潜在好处越来越多的证据导致了世界各地大量的专利申请[9]。

FK-228不含环氧酮基的环四肽类化合物的双环，是从紫色素杆菌肉汤中分离得到。分子式为C24H36N4O6S2。在细胞介质、血浆中的FK-228能穿透细胞膜从而实现其稳定物理性能。有最新研究表明，免疫性疾病、炎症的治疗、抑制血管生成、抗耐药性及神经系统等疾病FK-228有明显作用[10]。

FK-228对Tca-8113细胞的抑制增殖作用，随着药物浓度及时间的加长，Tca-8113细胞生长明显受到抑制作用，细胞变形明显、细胞凋亡、死亡增多。其机制可能与抑制HDAC1、HDAC2，加p19INK4d和p21Waf1/Cip1的表达，抑制CDK的表达有关。DNA ladder形成与HDAC1高度促进组蛋白乙酰化有关[11-12]。同时FK-228增加P21基因表达，减少S期细胞周期生成，细胞在G1期阻滞。组蛋白H3，H4乙酰化增加，通过非p53依赖型导致P21表达增加。诱导肿瘤细胞周期滞留在G1和G2/M[13]。

本实验显示，FK-228可以诱导Tca-8113细胞凋亡，凋亡原因可能是细胞凋亡的膜表面分子Fas/FasL基因启动，活化凋亡启使者caspase-3、caspase-8通路，下调Fas结合蛋白样白介素1β转换酶抑制蛋白表达，细胞骨架被重组，影响DNA结构、翻译、修饰诱导细胞凋亡[14]。张旭辉等[15]研究发现有丝分裂检查点激酶Bub1蛋白、Bubr1蛋白着丝粒定位、纺锤体检查点功能受到FK-228影响，有效抑制Survivin、AuroraB，肿瘤细胞的有丝分裂受到影响，肿瘤细胞受到杀伤。

综上所述，FK-228体外诱导Tca-8113凋亡，为今后的治疗口腔鳞癌的药物研究打下实验基础。

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（收稿日期：2018-03-16）