肾素—血管紧张素系统RAS在慢性应激状态下胰岛素分泌中的作用

邹雨桐　张智博　宋佩

[摘要] 目的 研究腎素-血管紧张素系统（RAS）在慢性应激诱导下的大鼠胰岛素分泌中所起作用。 方法 将20只SD大鼠随机分为4组，正常对照、电击组、卡托普利（captopril）处理加电击、坎地沙坦（candesartan）处理加电击。3个需要电击处理组连续电击4周，4组大鼠定期测量血压，在电击结束后行腹腔注射葡萄糖耐量（IPGTT）实验，在相应的时间点测定大鼠血糖水平，处死后收集血清和胰脏，测定血清中血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）和胰岛素水平，用Q-PCR测定各组大鼠的Pcsk1基因和Pcsk2基因的表达情况。 结果 在慢性应激情况下，只经电击处理的大鼠血压和血清血管紧张素Ⅱ水平均高于对照组大鼠的正常水平（P<0.05）；分别经过血管紧张素Ⅱ受体（AT1）拮抗剂-坎地沙坦（candesartan）和血管紧张素转化酶抑制剂-卡托普利（captopril）处理的两个组，大鼠的血压及Ang Ⅱ水平均低于对照组水平（P<0.05）。3组电击处理过的大鼠血清胰岛素水平均明显低于对照组（P<0.05）。电击4周后的IPGTT显示，4组大鼠的糖耐量水平表现无显著差异。3个电击处理组大鼠Pcsk1基因的表达相比对照组明显降低（P<0.05），各组大鼠Pcsk2基因表达无明显差异。 结论 在慢性应激4周的情况下，大鼠胰岛素分泌出现显著下降，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）处理并未改善慢性应激诱导引起的胰岛素分泌下降，因此，RAS系统可能未参与慢性应激诱导的胰岛素分泌下降。

[关键词] 肾素-血管紧张素系统（RAS）；应激；胰岛素；糖尿病

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）20-0036-05

The role of renin-angiotensin system（RAS） in insulin secretion under chronic stress

ZOU Yutong1 ZHANG Zhibo1 SONG Pei1 XU Qun1 ZHANG Guoxing2

1.The First School of Clinical Medicine， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China； 2.Faculty of Physiology， School of Basic Medicine and Life Sciences， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China

[Abstract] Objective To study the role of renin-angiotensin system（RAS） in the insulin secretion of rats induced by chronic stress. Methods 20 SD rats were randomly divided into 4 groups： a normal control group， a shock group， captopril treatment plus electric shock， and candesartan treatment plus electric shock. Three groups which needed electric shocks were given electric shock for 4 weeks consecutively. Four groups of rats were regularly given measurement of blood pressure. At the end of the shock， an intraperitoneal glucose tolerance test（IPGTT） was performed. The rats' blood glucose levels were measured at the corresponding time points. Serum and pancreas were collected after sacrifice. The serum angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ） and insulin levels were measured， and the expression of Pcsk1 gene and Pcsk2 gene in each group of rats was determined by Q-PCR. Results Under chronic stress conditions， the blood pressure and serum angiotensin Ⅱ levels in rats treated with electroshock were higher than the normal levels in the rats from the control group（P<0.05）； in group treated with angiotensin Ⅱ receptor（AT1） antagonists-candesartan and angiotensin converting enzyme inhibitor-captopril respectively， the blood pressure and Ang Ⅱ levels in rats were lower than those in the control group（P<0.05）. The serum insulin levels in rats treated with electroshock in the three groups were significantly lower than those in the control group（P<0.05）. IPGTT after 4 weeks of electroshock showed no significant difference in glucose tolerance levels between the four groups. Compared with the control group， the expression of Pcsk1 gene in the three electroshock groups was significantly lower（P<0.05）. There was no significant difference in the expression of Pcsk2 gene between all groups. Conclusion In the case of chronic stress for 4 weeks， insulin secretion is significantly reduced in rats. Treatment with captopril and candesartan do not improve the reduction of insulin secretion induced by chronic stress induction. Therefore， RAS system may not be involved in the chronic stress-induced decrease in insulin secretion.

[Key words] Renin-angiotensin system（RAS）； Stress； Insulin； Diabetes

近40年来，我国经济社会发展迅猛，人口老龄化趋势明显，糖尿病等多发生于老年人群的代谢性疾病发病率呈现出显著增高的趋势，当前我国统计的数据显示，国内现有15.5%患有糖尿病[1]。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）作为一种临床常见的糖尿病类型，是以胰岛 B细胞功能缺陷和胰岛素抵抗为主要病理生理改变的代谢性疾病，目前认为由遗传和环境因素互相作用引起。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛 B细胞功能缺陷在糖尿病的发展过程中扮演重要角色[2]。胰岛素抵抗是机体对一定量或浓度的胰岛素的生物效应减低，主要指机体由胰岛素介导的葡萄糖摄取和代谢能力减弱，包括胰岛素的敏感性下降和反应性下降[3]。有关T2DM胰岛素抵抗的发生机制比较复杂，一直是研究的热点。本文将讨论慢性应激引起的胰岛素分泌不足及RAS系统在其中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验采用20只SD大鼠，苏州大学医学部实验动物中心提供[许可证号：SYXK（苏）2017-0043]，均为雄性，体重200～250 g，喂养条件如下：5只一笼，室温25℃，湿度50%～60%，通风良好，自由摄食、饮水，常规日夜周期环境下实验室饲养。

实验所用药物为血管紧张素Ⅱ受体1阻断剂坎地沙坦（candesartan）（成都艾科达化学试剂有限公司，AR，99.0%，1g，CAS：145040-37-5）及血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂卡托普利（captopril）[东京化成工业株式会社，>98.0%（HPLC）（T），CAS：62571-86-2]，将药物溶解即可使用。

1.2 实验动物处理

将SD大鼠随机平均分为4组（n=5）：对照组、电击组、卡托普利（captopril）处理加电击组、坎地沙坦（candesartan）处理加电击组。药物处理组每天上午给药（剂量为卡托普利100 mg/kg，坎地沙坦10 mg/kg），三个电击处理组每天上午和下午电击，一次持续2 h，共电击4周，期间定期测量大鼠血压。电击的最后1 d，电击完成后禁食，取血清第2天进行IPGTT试验，随后处死大鼠，取胰腺进行后续指标的测定。

1.3 观察指标

（1）血压测定：每7天采用尾袖法通过无创血压仪测定清醒安静状态下的各组大鼠尾动脉的收缩压和心率。测量血压前将大鼠预置于37℃的恒温箱中，持续10～20 min，使其尾部动脉扩张便于测量。在动物适应环境、行为稳定后，开始测量，连续测3次，取其均值。（2）IPGTT：在腹腔注射葡萄糖前和腹腔注射葡萄糖后的10 min、15 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min的时间点测量血糖。（3）血清：使用试剂盒测定大鼠血清中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和胰岛素的含量。（4）Q-PCR：研磨和匀浆样品，提取总mRNA，以mRNA为模板，采用Oligo随机引物，利用逆转录酶反转录生成cDNA。再以cDNA作为模板配制PCR反应体系，放入实时荧光定量PCR仪中，设定好程序后开始反应，记录CT值。具体步骤如下：以mRNA为模板经逆转录合成cDNA，每个反应体系共20 μL，SYBR Premix EX Taq Ⅱ（Tli RNasH Plus）（2×） 10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，RT反应液（cDNA溶液）2 μL，ddH2O 6 μL。将准备好的96孔板置于实时荧光定量PCR仪中，设定好程序后开始反应。本实验的反应条件为：（1）预变性阶段：95℃ 2 min，1 cycle。（2）热循环阶段：95℃ 15 sec，60℃ 1 min，40 cycle。（3）溶解曲线：95℃ 15 sec，60℃ 15 sec，95℃ 15 sec，1 cycle。各基因引物如下。见表1。

1.4 统计学方法

用SPSS17.0 for Windows 统计软件，计量资料用（x±s）表示，采用t检验比较组内差异，检验组间差异进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血压情况

从第7天开始，对照组和电击组血压有明显差异，第7天（t=3.138，P<0.05）、第14天（t=6.975，P<0.05）、第21天（t=11.879，P<0.05）和第28天（t=39.500，P<0.05）电击组血压均高于对照组。第7天开始，卡托普利处理加电击组血压明显低于电击组（t=4.808，P=0.01<0.05），此后第14天（t=5.769，P<0.05）、第21天（t=19.269，P<0.05）、第28天（t=7.538，P<0.05）卡托普利处理加电击组血压均低于电击组。

第7天开始，坎地沙坦处理加电击组血压明显低于电击组（t=7.931，P<0.05），此后第14天（t=8.406，P<0.05）、第21天（t=12.612，P<0.05）、第28天（t=46.040，P<0.05）坎地沙坦处理加电击组血压均低于电击组。

以上结果表明电击組导致大鼠血压升高，卡托普利和坎地沙坦有降血压的作用。见图1及表2。

2.2 大鼠血清Ang Ⅱ情况

比较各组大鼠血清Ang Ⅱ情况，与对照组大鼠血清Ang Ⅱ（5.39±0.51 ng/mL）相比，电击组大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）显著升高（t=3.569，P<0.05），与电击组大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）相比，卡托普利处理加电击组（2.10±0.32 ng/mL）（t=7.752，P<0.05）及坎地沙坦处理加电击组（2.73±0.44 ng/mL）（t=6.633，P<0.05）显著降低，可见两药物阻断RAS系统而且效果明显。见图2。

2.3 IPGTT各组血糖情况

在注射葡萄糖溶液之前测血糖发现对照组高于电击组（t=3.000，P<0.05），卡托普利处理加电击组与电击组无明显差异，坎地沙坦处理加电击组血糖值比电击组高（t=7.608，P<0.05）。

在腹腔注射葡萄糖后，各组血糖在15 min达到峰值，峰值时坎地沙坦处理加电击组高于电击组，高于卡托普利处理加电击组，对照组最低，电击组血糖水平顯著高于对照组（t=2.530，P<0.05）。随后血糖下降的过程，对照组下降较慢，卡托普利处理加电击组下降较快。60 min时，对照组血糖水平显著高于电击组（t=3.968，P<0.05），卡托普利处理加电击组血糖水平显著低于电击组（t=2.601，P<0.05），坎地沙坦处理加电击组与电击组无明显差异。90 min时，对照组血糖水平显著高于电击组（t=2.640，P<0.05），卡托普利处理加电击组血糖水平显著低于电击组（t=3.833，P<0.05）。120 min时，对照组血糖水平和电击组无明显差异，卡托普利处理加电击组血糖水平显著低于电击组（t=3.503，P<0.05）。见图3及表3。

2.4 大鼠血清胰岛素情况

比较各组大鼠血清胰岛素水平，相比于对照组（9.15±0.22 μg/L），电击组（6.83±0.28 μg/L）（t=6.526，P<0.05）、卡托普利处理加电击组（6.28±0.74 μg/L）（t=3.746，P<0.05）和坎地沙坦处理加电击组（6.47±0.58 μg/L）（t=4.360，P<0.05）血清胰岛素水平均明显低于对照组。见图4。

2.5 大鼠Pcsk1和Pcsk2基因表达情况

比较各组大鼠Pcsk1基因的表达情况，相比对照组（1.23±0.09），电击组（0.98±0.06）（t=3.754，P<0.05）、卡托普利处理加电击组（0.92±0.06）（t=4.421，P<0.05）及坎地沙坦处理加电击组（0.84±0.07）（t=5.390，P<0.05）三组Pcsk1表达明显降低，各组大鼠Pcsk2基因表达无明显差异。见图5。

3 讨论

关于糖尿病发病的两种机制，胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能障碍均可以导致血糖水平升高，胰岛B细胞的功能障碍可引起高血糖，而高血糖又加重胰岛B细胞的功能障碍[4]。胰岛B细胞功能障碍在糖尿病早期是可逆的，因此在疾病早期需通过及时控制血糖水平、保护胰岛B细胞功能，使胰岛B细胞功能得到最大程度的恢复[5]。但随着疾病的进展，由于细胞凋亡等原因导致胰岛B细胞总量减少，直至其功能损害无法逆转[6]。

慢性应激（Unpredictable chronic mild stress）长期以来被用于动物实验来制造抑郁导致的身体机能紊乱的模型，是一种可靠的模拟方法，其中就包括胰岛素分泌异常，而且有调查显示这种应激会引起抑郁进而增加个体患糖尿病的可能性[7，8]。另外有研究显示慢性应激会影响胰岛素分泌和导致糖耐量异常，而且会影响胰腺上葡萄糖转运蛋白（glucose transporter-2，GLU2）的水平，导致胰岛素抵抗[9，10]。

血管紧张素Ⅱ受体1阻断剂坎地沙坦（candesartan）和血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂卡托普利（captopril）是常用的降血压药物。有研究显示AngⅡ具有调节胰岛素的生物学功能[11]，因为AngⅡ和胰岛素有一段共同的信号转导途径，AngⅡ激活AT1受体抑制胰岛素通过PI3K途径介导的葡萄糖的转运、糖元合成等，可见RAS系统可以影响胰岛素代谢[12]。Shiuchi等[13]研究发现ACEI使2型糖尿病小鼠骨骼肌细胞的2-去氧葡萄糖的摄取能力增加，另外有研究显示ARB类药物有改善胰岛素调节的作用[14]。在临床试验方面有卡托普利预防实验（Captopril prevention project，CAPPP）观察到卡托普利控制高血压的病人中新的2型糖尿病发病率低[15]，LIFE（Losartan intervention for endpoint reduction in hypertension study，2002）实验发现氯沙坦使新发糖尿病发生率降低[16]，可见ARB及ACEI类药物一定程度上可以改善胰岛素代谢以及减少糖尿病的发生。

本研究显示，慢性应激使大鼠出现胰岛素分泌不足的情况，RAS系统未参与此过程。实验使用无规律电击的方法来模拟慢性应激，经过4周的电击，电击处理组的大鼠出现血清胰岛素下降的情况，提示长时间应激导致胰岛素分泌水平下降。有研究发现，应激状态下的神经内分泌反应主要是下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活，机体通过腺垂体释放促肾上腺皮质激素，导致儿茶酚胺类物质分泌增多[17]。儿茶酚胺动员机体的脂肪、肝糖元和肌糖元，使胰高血糖素分泌增加，促进糖元分解，同时又抑制胰岛素的分泌。此外，长期电击可能导致内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白质发生堆积或钙离子平衡发生紊乱，内质网分子伴侣Bip（immunoglobulin binding protein）解离出来与未折叠蛋白或者错误结合蛋白结合，使得由肌醇依赖酶IRE-1，活化转录因子ATF6和RNA 依赖的蛋白激酶样激酶PERK参与的信号转导系统被激活，从而导致内质网应激（endoplasmic recticulum stres）的发生[18，19]。胰岛素从内质网开始合成，胰岛素原在此正确折叠，然后运输至高尔基体经过进一步的加工，形成成熟的胰岛素来发挥作用。错误折叠的胰岛素原等蛋白质在内质网中蓄积，通过 PERK介导的 elF2磷酸化和转录诱导ATF4及凋亡基因 CHOP的表达导致胰岛B细胞死亡[20]。以上可能是胰岛素分泌不足的机制。Pcsk1基因编码的前蛋白转化酶（Proprotein eonvertase 1，PC1）是胰岛素源转化为胰岛素的一个重要关键酶，通过荧光定量PCR检测到电击处理组的Pcsk1基因表达明显降低，进一步证明慢性应激影响导致胰岛素分泌水平下降。

分析大鼠血压和血清AngⅡ水平发现，电击导致大鼠的血压升高及血清AngⅡ水平的升高，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）成功阻断了RAS系统导致两给药组的AngⅡ水平及血压的降低，但是两给药组的Pcsk1基因表达水平与单纯电击组无明显差异，而且两给药组的血清胰岛素水平与单纯电击组也无明显差异，提示阻断RAS系统并未改善慢性应激诱导引起的胰岛素分泌不足。另外分析IPGTT实验情况，各组血糖在15 min时达到峰值，峰值时坎地沙坦处理加电击组高于电击组，高于卡托普利处理加电击组，在血糖恢复的过程，卡普托利组恢复好于电击组，坎地沙坦处理组与单纯电击组无明显差异，对照组恢复情况最差，提示阻断RAS系统并未改善胰岛素分泌不足的情况，各组大鼠未出现糖尿病的表现。

综上所述，在慢性应激诱导4周情况下，阻断RAS系统不能改善慢性应激导致的胰岛素分泌不足。本实验对大鼠进行慢性应激的时间为4周，导致大鼠出现胰岛素分泌不足情况，但是因为慢性应激时间较短，大鼠处于一种可代偿的状态，而未出现糖尿病症状。

[参考文献]

[1] 马静静，高鹏霞，张红，等.细胞因子与胰岛素抵抗研究新进展[J].中国老年学杂志，2015，35（17）：5032-5034.

[2] 陈宇，王立伟，李玲，等.妊娠糖尿病患者分娩后胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能研究[J].中国实用内科杂志，2011，31 （1）：42-44.

[3] Himsworth HP. Diabetes mellitus： Its differentiation into insulin-sensitive and insulin-insensitive types[J]. International Journal of Epidemiology，2013，42（6）：1594-1598.

[4] 马海林，朱筠.2型糖尿病人群胰岛素抵抗及胰岛B细胞功能缺陷的评估[J].中国医学前沿杂志（电子版），2016，8（11）：88-92.

[5] 黄帅，叶山东，陈燕.新诊断2型糖尿病患者胰岛β细胞功能相关因素的研究[J].中国糖尿病杂志，2015，23（1）：32-36.

[6] 凌云志，叶山东.2型糖尿病胰岛B细胞功能损伤的机制[J].国外医学（老年医学分册），2009，30（6）：262-266.

[7] Deng XY，Xue JS，Li HY，et al. Geraniol produces antidepressant-like effects in a chronic unpredictable mild stress mice model[J]. Physiology & Behavior，2015，152（Pt A）：264-271.

[8] Anderson RJ，Freedland KE，Clouse RE，et al. The prevalence of comorbid depression in adults with diabetes：A meta-analysis[J]. Diabetes Care，2001，24（6）：1069.

[9] Sadeghimahalli F，Karbaschi R，Zardooz H，et al. Effect of early life stress on pancreatic isolated islets insulin secretion in young adult male rats subjected to chronic stress[J]. Endocrine，2015， 48（2）：493-503.

[10] Su Q，Tao W，Wang H，et al. Umbelliferone attenuates unpredictable chronic mild stress induced-insulin resistance in rats[J]. Iubmb Life，2016，68（5）：403-409.

[11] Velloso LA，Folli F，Sun XJ，et al. Cross-talk between the insulin and angiotensin signaling systems[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，107（2）：133-139.

[12] 周亦秋，楊国君. RAS与胰岛素抵抗——代谢综合征新的治疗靶点[J]. 心血管病学进展， 2006，27（6）：753-755.

[13] Shiuchi T，Cui TX，Wu L，et al. ACE inhibitor improves insulin resistance in diabetic mouse via bradykinin and NO[J]. Hypertension，2002，40（3）：329-334.

[14] Katovich MJ，Iyer SN. Effect of acute and chronic losartan treatment on glucose tolerance and insulin sensitivity in fructose-fed rats[J]. American Journal of Hypertension，1996，9（7）：662.

[15] Scheen AJ.CAPPP trial. Captopril Prevention Project[J]. Lancet，1999，353（9166）：1795-1796.

[16] Lajos M，Kórház SJ. LIFE-diabetes（Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study in patients with diabetes）[J]. European Journal of Pharmacology，1998，114（2）：239-240.

[17] 杨成君，王灿，尹忠伟，等. 冷暴露对大鼠机体能量代谢影响[J]. 中国公共卫生，2007，23（12）：1469-1470.

[18] Liu H，Cao MM，Wang Y，et al. Endoplasmic reticulum stress is involved in the connection between inflammation and autophagy in type 2 diabetes[J]. General& Comparative Endocrinology， 2015，210（2）：124.

[19] Ni M，Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases[J]. Febs Letters，2007，581（19）：3641.

[20] Teodoromorrison T，Schuiki I，Zhang L，et al. GRP78 overproduction in pancreatic beta cells protects against high-fat-diet-induced diabetes in mice[J]. Diabetologia，2013，56（5）：1057-1067.

（收稿日期：2018-04-13）