不同严重程度急性胰腺炎患者血小板线粒体氧化功能比较

黄建刚，杨青，胡翠，冯慧，鲍峻峻，王兵兵，梅俏，许建明

(1安徽医科大学第一附属医院，合肥230022；2马鞍山市人民医院)

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急重症，有20%～30%的AP患者可发展成重症急性胰腺炎(SAP)，引起多器官功能障碍，导致死亡[1]。全身炎症反应(SIR)是AP多器官功能障碍发生发展过程中的关键环节。全身炎症反应综合征(SIRS)常见于脓毒症、外伤、烧伤、急性胰腺炎等疾病[2]。线粒体功能障碍可抑制细胞能量生成及氧自由基的异常增多，导致细胞氧化损伤，扩大和加重炎症反应过程,因此，线粒体在SIRS中发挥关键作用。研究表明，血小板中具有数量众多的有功能的线粒体[3]，在AP过程中血小板功能会发生显著变化[4]。超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性可反映机体血小板抗氧化能力，丙二醛(MDA)可反映机体血小板受自由基攻击的严重程度。琥珀酸脱氢酶(SDH)和ATP酶均与线粒体氧化磷酸化有关。线粒体损伤时，因氧化磷酸化功能受到抑制，线粒体结构发生改变即线粒体肿胀度增加，影响线粒体正常功能。本研究通过检测AP患者血小板中线粒体有关氧化损伤和能量代谢功能指标的变化，为AP病情评估和治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年9月～2017年3月我院收治的AP患者40例，均符合急性胰腺炎诊治指南(2014)制定的诊断和分类标准[5]，按病情严重程度分为轻症急性胰腺炎(MAP)组25例、中度重症急性胰腺炎(MSAP)组12例、SAP组3例。MAP组男15例、女10例，年龄(57.76±13.92)岁，APACHE-Ⅱ评分(3.24±2.71)分，BISAP评分(1.00±1.04)分，改良CT评分(2.48±0.87)分；MSAP组男9例、女3例，年龄(68.17±15.19)岁，APACHE-Ⅱ评分(6.58±2.50)分，BISAP评分(2.25±0.87)分，改良CT评分(3.00±1.04)分；SAP组男2例、女1例，年龄(66.67±12.09)岁，APACHE-Ⅱ评分(11.67±0.58)分，BISAP评分(6.00±5.19)分，改良CT评分(4.67±1.15)分。对照组为同期我院健康查体者9例，男4例、女5例，年龄20～50岁。各组性别、年龄具有可比性。本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 血小板的制备 AP患者于入院后24 h内、对照组空腹12 h后，采集空腹静脉血10 mL，EDTA抗凝，4 ℃离心20 min，取上清即为富含血小板的血浆。将血浆4 ℃离心10 min，弃上清，所得沉淀即为血小板。加入与血浆等体积的生理盐水将血小板重悬，室温保存待测。

1.3 血小板SOD、MDA、GSH-Px、SDH、ATP酶水平检测 采用BCA法。取适量血小板悬液，使用分光光度计(比色法)检测GSH-Px、ATP酶、MDA、SDH水平，使用酶标仪(比色法)检测SOD水平。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书操作。

1.4 血小板线粒体肿胀度检测[6]取适量血小板悬液，按细胞线粒体提取试剂盒说明书提取线粒体。配制肿胀度测定液，肿胀度测定液1：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸盐3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L；肿胀度测定液2：蔗糖250 mmol/L，琥珀酸盐3 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，CaCl20.3 mmol/L。将1 mg待测线粒体样品与1 mL测定液1或2混匀，以参比杯调零。于25 ℃、0～10 min内连续测定线粒体样品在520 nm处的吸光度A值。由于线粒体肿胀时，其吸光度在一定波长下降低，因此以吸光度A值的降低值表示线粒体肿胀度。

2 结果

2.1 各组血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比较 与对照组比较，MAP组、MSAP组、SAP组MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低；与MAP及MSAP组比较，SAP组血小板MDA水平增高，SOD、GSH-Px水平降低(P均<0.05)。见表1。

表1 不同程度AP患者血小板SOD、GSH-Px、MDA水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05。

2.2 各组血小板ATP酶、SDH水平比较 与对照组比较，MSAP组、SAP组血小板ATP酶及SDH水平降低；与MSAP组比较，SAP组血小板ATP酶和SDH水平降低(P均<0.05)。见表2。

表2 不同程度AP患者血小板ATP酶、SDH水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与SAP组比较，#P<0.05。

2.3 各组血小板线粒体肿胀度比较 加入测定液后，对照组吸光度逐渐下降，MAP组吸光度下降幅度较对照组低，MSAP组吸光度下降幅度较MAP组低，SAP组吸光度下降幅度较MSAP组低(P均<0.05)。见表3、4。

表3 各组加入测定液1后血小板线粒体肿胀度比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与MAP组比较，#P<0.05；与MSAP组比较，☆P<0.05。

表4 各组加入测定液2后血小板线粒体肿胀度比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与MAP组比较，#P<0.05；与MSAP组比较，☆P<0.05。

3 讨论

AP是由多种病因引起的胰酶激活，继以胰腺局部炎症反应为主要特征，研究表明，氧化应激与线粒体功能障碍参与了胰腺腺泡细胞损伤的过程[7]。线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生细胞代谢必需的能量物质ATP。此外，线粒体介导氧自由基的产生和清除，线粒体是产生活性氧(ROS)的主要部位，当线粒体发生损伤时，氧应激被过度激活，活性氧合成增多，抑制线粒体的生物合成和稳态维持，损伤线粒体膜使膜电位下降，导致ATP生成减少及细胞内环境紊乱，最终导致细胞死亡。在雨蛙肽诱导的实验性AP模型中，早期可出现胰腺腺泡上皮细胞的线粒体电子传递系统的功能障碍，胰腺线粒体合成ATP的能力下降，ROS水平明显增高，ROS增高程度与AP严重程度有关[8]。因此，胰腺线粒体中异常增加的氧化反应或降低的抗氧化能力是AP发病机制的重要基础。

尽管在AP的实验模型中被证实存在线粒体功能的改变，但是在AP患者中获得胰腺组织进行活检来检测线粒体功能很难实现且不符合伦理。因此，检测外周血中的线粒体功能是了解AP患者机体线粒体功能的一种可行方法[9]。研究表明，血小板的线粒体功能障碍与脓毒血症的临床疾病活动度有关[10]。在脓毒血症和心源性休克患者血小板中，线粒体呼吸功能受到抑制，ATP生成减少[11]。在连续流动左心室辅助装置植入术后发生SIRS的患者中，血小板线粒体膜电位明显升高，线粒体损伤严重[12]。SIRS是SAP病理生理过程中的关键环节，因此了解血小板中线粒体功能的变化对探讨AP发病过程中炎症损伤的机制具有重要意义。

氧化损伤是引起AP发病的重要因素，SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化因子，通过抑制脂质过氧化反应，保护细胞膜的结构和功能完整。MDA是机体脂质过氧化产物之一，反映了机体脂质过氧化的程度。本研究结果显示，与对照组比较，AP患者血小板中MDA水平升高，SOD和GSH-Px活性降低；SAP组MDA水平高于MAP组和MSAP组，SOD和GSH-Px活性低于MAP组和MSAP组。表明AP患者机体抗氧化能力受到抑制，氧化损伤作用增强，其中SAP患者氧化损伤作用增强及抗氧化作用抑制更明显。

SDH是三羧酸循环的关键酶之一，参与细胞能量代谢，ATP酶可催化ATP分解为ADP释放能量，均与线粒体氧化磷酸化及能量供应有关。本研究结果显示，与对照组比较，AP患者血小板中SDH和ATP酶活性降低；SAP组SDH和ATP酶活性低于MAP组和MSAP组。表明AP患者氧化磷酸化及能量合成功能下降，其中SAP患者线粒体氧化磷酸化及能量合成功能抑制更明显。线粒体是细胞能量合成场所，AP发病抑制线粒体功能，SDH及ATP酶活性降低，导致机体能量代谢紊乱，提示线粒体能量合成功能受损与疾病严重程度相关。

AP可导致线粒体肿胀、线粒体膜去极化。线粒体通透性转换孔道开放引起的线粒体肿胀，吸光度在一定波长下减少。通过测定吸光值变化能够反映线粒体的肿胀度。本研究结果显示，与对照组比较，AP患者线粒体肿胀变化不明显，提示线粒体因结构及功能遭受破坏，对外环境酸碱度及Ca2+的变化不敏感；其中SAP组线粒体肿胀下降明显低于MSAP及MSAP患者血小板线粒体，提示SAP组血小板线粒体损伤更为明显，导致对外环境酸碱度及Ca2+的变化更加不敏感。因此，SAP组血小板线粒体功能损伤较MAP组和MSAP组更严重。提示线粒体功能损伤程度与疾病严重程度相关。

综上所述，AP患者血小板线粒体受到氧化损伤，能量合成功能受到抑制，SAP患者的受损程度更严重。