开心果总黄酮预处理对急性肝损伤小鼠肝组织的保护作用及机制

依明·尕哈甫，麦尔旦·吐尔逊麦麦提，热娜·卡斯木，韩南银

(1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011；2北京大学药学院)

肝损伤疾病发病率高、治疗难度大，如果未得到及时治疗，会进一步诱导脂肪肝、肝硬化、肝纤维化甚至肝癌的发生。肝损伤是多因素参与的复杂病理过程，研究表明，氧化应激和炎症在肝细胞病变过程中发挥重要作用[1]。然而，目前关于肝损伤的发病机制还未全面阐明，尚缺乏特效的治疗药物。开心果中含有的黄酮类化合物是一类具有多种生物活性的天然产物，具有抗氧化、抗炎、保肝等功能[2]。2017年12月～2018年3月，我们采用四氯化碳(CCl4)建立大鼠急性肝损伤模型，观察开心果总黄酮对血清谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)以及炎症因子白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响，并测定肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、还原型谷胱甘肽(GSH)等氧化应激指标和肝脏组织的病理学变化，探讨开心果总黄酮抗肝损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级健康昆明种小鼠50只，体质量(20±2)g，雌雄各半，购自新疆医科大学实验动物中心。开心果购自新疆维吾尔自治区维吾尔医院，取开心果粉末经10倍量的80%乙醇回流提取3次并减压浓缩，浓缩液经D101型大孔吸附树脂洗脱纯化，选取70%乙醇洗脱液并浓缩至浸膏，再经冷冻干燥成粉末，测得总黄酮含量为63.29%。将总黄酮干燥粉末用0.3%的羟甲基纤维素钠混匀。CCl4(天津永晟化学试剂厂)；总蛋白定量(BCA法)、SOD、MDA、NO和GSH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α检测试剂盒(博士德生物有限公司)。BS-450型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)；UV-754型紫外-可见分光光度仪(上海菁华科技仪器有限公司)；RT-6100型酶标仪(深圳雷社生命科学有限公司)；TGL-16M型冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；HH型恒温水浴锅(金坛科析仪器有限公司)。

1.2 动物分组与干预 将小鼠随机分为正常组、模型组及开心果总黄酮低、中、高剂量组各10只。开心果总黄酮低、中、高剂量组分别给予100、200、400 mg/kg开心果总黄酮灌胃，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，均1次/d，连续7 d。

1.3 肝损伤模型的建立 末次给药1 h后，正常组给予花生油溶液0.1 mL/10 g体质量腹腔注射，模型组和开心果总黄酮组小鼠均以0.1%的CCl4花生油溶液(0.1 mL/10 g体质量)腹腔注射建立急性肝损伤模型，禁食不禁水继续饲养8 h。

1.4 血清ALT、AST、IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平检测 造模后8 h，小鼠摘眼球取血1.5 mL，3 000 r/min离心10 min，取血清。使用全自动生化分析仪检测ALT、AST水平，酶标仪检测小鼠血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平，按ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 肝脏指数、脾脏指数测算 经颈椎脱臼处死小鼠，摘取肝脏和脾脏并称重，计算肝脏指数和脾脏指数。脏器指数=脏器湿重(mg)/小鼠体质量(g)。

1.6 肝组织病理学检查 剖取小鼠肝脏左叶距边缘0.5 cm处的组织置于10%甲醛溶液中固定，经HE染色法制备切片，在400倍光镜下观察小鼠肝组织病理学变化。

1.7 肝组织匀浆上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平检测 取0.5 g小鼠肝脏组织，置于冰生理盐水中冷藏，冰浴研磨成组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液。紫外分光光度法检测SOD、MDA、NO、GSH水平，按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 各组血清ALT、AST水平比较 与正常组比较，模型组血清ALT、AST水平均升高(P均<0.01)。与模型组比较，开心果总黄酮中、高剂量组血清ALT、AST水平均降低(P均<0.01)。见表1。

表1 各组血清ALT、AST水平比较

注：与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.01。

2.2 各组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比较 与正常组比较，模型组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平升高(P均<0.05)。与模型组比较，开心果总黄酮中、高剂量组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.3 各组肝脏指数、脾脏指数比较 与正常组比较，模型组肝脏指数、脾脏指数均升高(P均<0.05)。与模型组比较，开心果总黄酮中、高剂量组肝脏指数、脾脏指数均降低(P均<0.05)。见表3。

表3 各组肝脏指数、脾脏指数比较

注：与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.4 各组肝组织病理检查结果比较 正常组肝小叶结构完整，肝细胞结构清晰，无炎性细胞浸润及纤维组织增生，无明显变性坏死。模型组肝小叶结构和肝细胞排列紊乱，肝细胞水肿，部分肝细胞坏死或气球样改变，细胞质变疏松，肝细胞脂肪变性多见，可见碎片状和点状坏死，存在炎性细胞浸润。与模型组相比，开心果总黄酮组尤其是中、高剂量组，肝细胞水肿减轻，肝细胞坏死和脂肪变性减少，偶见浸润的炎性细胞，肝小叶结构基本完整，病理组织显著改善。

2.5 各组肝组织匀浆上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比较 与正常组比较，模型组肝组织中MDA、NO水平升高，SOD、GSH水平降低(P均<0.05)。与模型组比较，开心果总黄酮中、高剂量组血清MDA、NO水平降低，SOD、GSH水平升高(P均<0.05)。见表4。

表4 各组肝组织匀浆上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

肝脏作为体内重要的代谢和解毒器官，对化学物质、药物、免疫性疾病、乙醇等损伤因素非常敏感，肝损伤可表现为肝组织坏死、肝脂肪化、肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌[3]。肝损伤的治疗原则为维护肝细胞功能的稳定性，减少肝细胞组织炎症的程度，促进损伤组织的修复等[4]。目前治疗肝损伤的药物很多，如抗炎保肝类、修复肝细胞膜性结构类、解毒保肝类、抗肝纤维化类、利胆保肝类等。目前对肝损伤的防治仍是一个重要课题，通过实验性肝损伤动物模型筛选治疗肝损伤药物，探讨其作用机制，具有重要的现实意义。肝损伤过程大多与氧化应激和免疫有关，化学物质、药物、乙醇等能直接或间接诱导肝细胞生物膜系统发生脂质过氧化，干扰细胞内的能量代谢，活化细胞死亡程序等，最终以转氨酶升高为表现形成不同程度的肝功能失常[5]。CCl4可导致肝细胞脂质过氧化，破坏肝细胞生物膜结构的完整性，造成肝细胞损伤坏死，致使肝细胞内的两种转氨酶ALT和AST大量溢出并进入血液，血浆ALT、AST水平升高[6]。此外，产生的过多的自由基将会耗竭SOD、GSH而使其减少[7]，而脂质过氧化产物MDA和NO浓度会随着肝细胞膜结构和功能的损伤而显著提高[8]。肝损伤过程存在不同程度的肝脏炎症，并导致炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ等的释放增加[9]。近年来，中医药在治疗肝损伤研究中表现出了稳定的疗效、较少的不良反应等优势，特别是中药中含有的黄酮类化合物可以通过抗炎、提高肝组织抗氧化水平、消除自由基等作用保护肝脏[10]。

开心果是漆树科植物阿月浑子的果实或种子，是日常生活中常食用的一种干果，同时也作为中药民族药使用。据维吾尔医学典籍记载，开心果具有开通肝阻作用，主治肝脏有阻[11]。药理学研究显示，开心果具有抗炎和抗脂质过氧化作用[12]。开心果总黄酮中含有柚皮素、大豆苷元、染料木素、槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等黄酮类成分[13]，现代药理研究证实，其中的部分黄酮类化合物具有保肝作用[14，15]。本研究通过观察开心果总黄酮防治肝损伤的作用，为进一步开发开心果中具有保肝作用的有效成分提供理论依据。

本研究结果显示，给予开心果总黄酮预处理后，肝损伤小鼠血清ALT、AST水平降低，ALT和AST都属于转氨酶，转氨酶是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”，主要存在于肝细胞内，在肝细胞发生炎症、坏死、中毒等损伤时水平会升高，经开心果总黄酮给药治疗后，小鼠血清ALT和AST水平下降，说明开心果总黄酮抑制了转氨酶升高，肝损伤在逐渐恢复。开心果总黄酮各剂量组SOD、GSH均升高且NO、MDA均降低，显示了开心果总黄酮的抗氧化保肝作用；同时开心果总黄酮中、高剂量组血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ的炎性细胞因子水平显著下降，说明开心果总黄酮通过下调炎症反应作用来抑制炎症因子的产生，减缓对肝脏的毒性，减慢肝细胞坏死，从而起到对肝脏的保护作用。此外，给药后肝损伤小鼠的肝脏指数、脾脏指数均下降，小鼠肝脏的病理损伤程度得到显著改善，提示脏器充血、水肿、坏死等现象得到了纠正。

综上所述，开心果总黄酮对CCl4诱导的急性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能是抑制肝脏组织中自由基脂质过氧化反应，保护肝细胞膜的完整性，并降低血清ALT、AST水平，增强机体抗氧化能力，抑制炎症因子释放，减轻炎症反应，从而发挥抗炎和保肝的功效。