维拉帕米对脓毒症大鼠心肌细胞自噬水平的影响

姜琳，杨国辉

(贵州医科大学，贵阳550004)

脓毒症是感染所致全身炎症反应，可导致严重器官功能障碍。心脏是脓毒症最易受损器官之一，内毒素脂多糖、细胞因子、氧自由基等通过多种途径损伤心肌，可致脓毒性心肌病[1]。自噬作为一种细胞死亡方式已成为目前研究的热点。在脓毒症动物模型中观察到自噬体和自噬相关基因产物增加，自噬通过吞噬并降解病原微生物，与免疫反应共同保护机体[2]。2016年6月～2017年12月，我们通过观察脓毒症大鼠心肌微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关蛋白Beclin-1、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达的变化，并给予钙通道阻滞剂维拉帕米干预，探讨维拉帕米对脓毒症的心肌保护作用，为脓毒性心肌病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 SPF级健康雄性SD大鼠54只，体质量(200±20)g，由贵州医科大学实验动物中心提供。盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰公司)，兔源Beclin-1单克隆抗体、兔源LC3多克隆抗体、兔源Bcl-2单克隆抗体(Abcam公司)，兔源β-actin单克隆抗体(博奥森公司)，辣根酶标记抗山羊IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)，高灵敏化学发光检测试剂盒(默克密理博公司)。

1.2 动物分组与模型制备 将大鼠随机分为对照组、模型组、干预组各18只。模型组和干预组采用盲肠结扎穿孔术[3]制备脓毒症模型。术前禁食12 h，自由饮水。采用2%戊巴比妥钠10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹正中切口；于盲肠盲端1/3处结扎，使用20 G套管针将盲肠贯通穿孔，轻轻挤出少许粪便；将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。对照组麻醉后行下腹正中切口，取出盲肠不结扎穿孔仍放回腹腔。三组术后均给予生理盐水30 mL/kg腹腔注射，干预组另给予盐酸维拉帕米注射液5 mg/kg腹腔注射。待大鼠完全苏醒后送回饲养室正常饲养。

1.3 标本采集 三组分别于术后6、12、24 h各处死6只大鼠。取出心脏，生理盐水洗净，去除大血管及结缔组织，取心肌组织用于组织形态学检查和相关分子生物学检测。

1.4 血清肌钙蛋白T(cTnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)检测 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠10 mL/kg麻醉，暴露心脏，取心脏血5 mL，移至1.5 mL EP管中。离心，取上层血清，采用酶联免疫吸附法检测cTnT、CK-MB水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 心肌组织形态学检查 取大鼠心脏，用生理盐水洗净，去除大血管及结缔组织，取0.5 mm3心肌组织投入预先配好的固定液中(10%甲醛)，固定成功后放入包埋盒中，流水冲洗(去除组织中的固定液)30 min，梯度乙醇脱水，再将组织块置于透明剂二甲苯中，以二甲苯替换出组织块中的乙醇。将已透明的组织块置于石蜡中包埋，切片机将蜡块切成薄片，厚约5 μm，于水中摊平，贴到载玻片上，放入45 ℃恒温箱中烘干。二甲苯脱蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇，最后入蒸馏水，苏木精伊红染色后置于光镜下观察。

1.6 心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。使用蛋白提取试剂盒提取心肌组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白上样液进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶室温封闭2 h，TBST洗膜。分别加入LC3(1∶2 000)、Beclin-1(1∶2 000)、Bcl-2(1∶5 000)及β-actin(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的相应IgG二抗(1∶5 000)，室温孵育50 min。ECL化学发光显色，凝胶成像分析系统检测条带，Image J软件测出目的条带的灰度值，并与内参条带的灰度值比较，计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。TRIzol法提取大鼠心肌组织总RNA，测定浓度及纯度后按照试剂盒说明逆转录为cDNA，然后进行实时荧光定量PCR。引物序列：LC3上游引物5′-ATTGCTGTCCCGAATGTCTC-3′，下游引物5′-TTCTTCCTCCTGGTGAATGG-3′；Beclin-1上游引物5′-TATAGCAAAGAGCCCTGCCG-3′，下游引物5′-AACTGTGTGCCACAAGCATC-3′；Bcl-2上游引物5′-ACAGAGGGGCTACGAGTGGG-3′，下游引物5′-CGTTCGGTTGCTCTCAGGC-3′；β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。反应体系(25 μL)：SYBR®Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模2.0 μL，dH2O 8.5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。反应结束后读取各样本的Ct值，应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清cTnT、CK-MB水平比较 见表1。

表1 三组血清cTnT、CK-MB水平比较

注：与对照组相同时间比较，aP<0.05；与模型组相同时间比较，bP<0.05；与同组6 h比较，cP<0.05；与同组12 h比较，dP<0.05。

2.2 三组心肌组织形态学比较 对照组心肌细胞排列整齐，间质无明显增生，心肌细胞无明显肥大等表现；模型组心肌细胞排列紊乱，明显肥大，胞质丰富，可见血管扩张和血管壁增厚；干预组心肌细胞排列紊乱、肥大程度较模型组减轻。

2.3 各组心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达比较 见表2。

表2 各组心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达比较

注：与对照组相同时间比较，aP<0.05；与模型组相同时间比较，bP<0.01；与同组6 h比较，cP<0.05；与同组12 h比较，dP<0.05。

2.4 各组心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达比较 见表3。

3 讨论

脓毒症病情进展迅速，临床治疗效果差，病死率高。研究表明，约50%的脓毒症患者可出现心脏功能障碍,伴有心脏功能障碍患者的病死率达70%，而不伴心脏功能障碍患者的病死率为20%[4]。脓毒症心肌损伤的机制包括内皮素1升高、线粒体受损、炎症因子对心肌的损伤、前列环素升高、缺血再灌注和氧自由基损伤、细胞钙超载等[5]。cTnT、CK-MB是检测心肌细胞受损的可靠指标，二者升高提示病情进行性加重，可能存在心脏功能障碍和预后不良[6]。本研究结果显示，模型组6、12、24 h时血清CK-MB、cTnT均较对照组升高，模型组血清CK-MB、cTnT随时间延长逐渐增高，干预组血清CK-MB、cTnT均较模型组降低。上述结果提示脓毒症大鼠心肌细胞损伤，予维拉帕米干预后可保护心肌细胞，减轻心肌损伤。

表3 各组心肌组织LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达比较

注：与对照组相同时间比较，aP<0.05；与模型组相同时间比较，bP<0.01；与同组6 h比较，cP<0.05；与同组12 h比较，dP<0.05。

自噬是指在应激条件下，如饥饿、营养缺乏、微生物入侵等，在自噬基因ATG调控下，可发生适应性细胞自噬现象，以维持细胞结构、功能和代谢的需要，维持细胞正常的生理功能。自噬包括诱导、自噬体形成、自噬溶酶体形成、降解和降解物质的循环再利用四个环节[7]。自噬体标记蛋白LC3贯穿自噬体形成的过程。LC3是自噬体膜上的标记蛋白，参与吞噬泡的形成，贯穿自噬体形成的始终。细胞内存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，自噬过程中，一部分LC3-Ⅰ转变成LC3-Ⅱ，而LC3蛋白在细胞内总的表达水平无明显上调，即自噬表现为LC3-Ⅰ减少和LC3-Ⅱ增加，通过LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反映自噬水平[8]。Beclin-1是与酵母Apg6/Vps30同源基因，可通过结构域结合于自噬体细胞膜上，在自噬中的作用主要调节自噬体膜的延伸过程，成为检测自噬的指标之一，研究发现，抗凋亡蛋白Bcl-2能通过疏水凹槽与Beclin-1结合，从而抑制Beclin-1及其复合体诱导自噬的功能[9]。

随着对自噬的深入研究，自噬在炎症、感染等病理生理过程的积极作用逐渐被重视，自噬为脓毒症相关的器官功能障碍的防治提供了新的方向。Hsieh等[10]报道，小鼠盲肠结扎穿孔术后8 h即可出现自噬相关蛋白LC3、Beclin-1升高，随着病程进展，自噬泡数量增加而自噬溶酶体数量较少；提示自噬在脓毒症早期即被激活，随着脓毒症小鼠体内大量促炎性因子释放，中和微生物毒素、控制细胞因子释放等作用下，从而抑制自噬水平，自噬溶酶体形成障碍，使得脓毒症过程中自噬没有发挥有效保护作用，从而导致脏器损伤。Tong等[11，12]报道，大鼠缺血缺氧心肌组织自噬激活后，自噬相关蛋白LC3、Beclin-1较对照组增高，Bcl-2较对照组降低，诱导自噬过程完整后可对心肌起到保护作用。

自噬是由内质网应激引发，并由内质网钙离子含量和释放调节，脓毒症时细胞钙通道失衡、钙超载从而激活自噬。自噬的发生及调节机制相当复杂，通过对自噬水平调控的研究，可使自噬在疾病过程中发挥积极保护作用。细胞内钙离子是调控自噬的重要因素，维拉帕米为钙通道阻滞剂，抑制钙离子内流，而钙离子对激活自噬具有积极作用[13，14]。钙离子浓度增加可促进自噬相关基因5增加和自噬过程中细胞信号调控相关的腺苷酸活化蛋白激酶表达，从而上调细胞自噬水平[15]。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组心肌细胞明显肥大，排列紊乱，模型组6、12、24 h时血清CK-MB、cTnT均较对照组升高，LC3、Beclin-1蛋白及mRNA表达较对照组升高，Bcl-2蛋白及mRNA表达较对照组降低；模型组血清CK-MB、cTnT随时间延长逐渐增高，LC3、Beclin-1蛋白及mRNA随时间延长逐渐升高，Bcl-2蛋白及mRNA随时间延长逐渐下降。提示脓毒症时心肌细胞钙通道失衡、钙超载及微生物入侵等因素心肌细胞受损并激活自噬，在24 h内随时间延长自噬逐渐增强。与模型组比较，干预组心肌组织排列紊乱、心肌细胞肥大严重程度较轻，干预组12、24 h时LC3较模型组降低，6、12、24 h时Beclin-1蛋白及mRNA表达较模型组降低，Bcl-2蛋白及mRNA表达较模型组升高，血清CK-MB、cTnT均较模型组降低。表明脓毒症大鼠心肌细胞出现钙通道失衡，激活自噬，给予维拉帕米拮抗钙超载后，可抑制自噬，保护心肌细胞。

综上所述，脓毒症大鼠心肌组织自噬早期可被激活，并在24 h内逐渐增强；通过维拉帕米调控细胞内钙离子从而调节自噬水平后，可有效抑制自噬，进一步保护心肌。