淫羊藿苷对涎腺腺样囊性癌细胞增殖和凋亡的影响

王雨，李萍

(1江汉大学医学院，武汉430056；2遵义医学院附属口腔医院)

涎腺腺样囊性癌(SACC)是常见的涎腺恶性肿瘤，以嗜神经性强、易远处转移为特点，长期生存率低。增殖细胞核抗原(PCNA)和生长素(Survivin)在SACC组织中表达异常，其与SACC的发生和发展密切相关[1，2]。目前临床治疗SACC主要采取手术结合放化疗，但由于其较强的浸润性，无法完全根除，术后复发率高，且放化疗不良反应严重，价格也比较昂贵，因此研究出一种新的廉价、高效、低毒的治疗药物意义重大。淫羊藿为小檗科草本植物，具有强筋骨、壮阳、祛风湿等功效。淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿的主要单体成分，具有调节内分泌、改善心血管功能、抗氧化、增加免疫活性及抗肿瘤等作用，其在抗肿瘤方面的表现备受关注[3]。2016～2017年，我们观察了ICA对SACC细胞增殖和凋亡的影响，通过检测细胞中PCNA、Survivin表达的变化，探讨ICA治疗SACC的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 SACC-M细胞系来自中国典型培养物保藏中心，ICA来自遵义医学院药理教研室。单克隆抗体PNCA、Survivin(上海基因科技公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Thermo Fisher公司)，实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)，全自动酶标检测仪(Thermo，美国)，蛋白电泳系统(BIO-RAD，美国)，TMS-1015型倒置显微镜(OLYMPUS，日本)，流式细胞仪(BD，美国)。

1.2 细胞培养与分组 向细胞中加入含10%胎牛血清和青-链霉素的改良型RPMI1640培养基、5% CO2、37 ℃培养箱中培养。取对数生长期细胞，分为对照组和ICA低、中、高浓度组，每组设6个复孔。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用MTT实验。取对数生长期细胞，加入胰酶消化，调整细胞密度为1×105/mL。按100 μL/孔加入96孔板中，培养24 h。弃培养液，ICA低、中、高浓度组分别加入终浓度100、200、400 μg/mL的ICA，对照组加入细胞培养液，每组设6个复孔，另设不加细胞的培养液作为空白对照。分别于培养24、48、72 h后，取出96孔板，每孔再放入20 μL MTT，培养4 h。去除孔内的培养液，加入DMSO 150 μL，震动15 min左右，使结晶完全溶解。用酶标仪在490 nm处测定各孔光密度OD值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验孔OD值-空白对照孔OD值)/(对照孔OD值-空白对照孔OD值)]×100%。实验重复3次。

1.4 细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按2×105/孔接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱内孵育24 h。ICA低、中、高浓度组分别加入终浓度100、200、400 μg/mL的ICA，对照组加入细胞培养基。培养24 h后，常规消化细胞，冷PBS冲洗，2 000 r/min离心5 min。加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI混匀，室温避光反应15 min，1 h内上流式细胞仪检测，分析各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=AnnexinⅤ阳性的早晚期凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 细胞中PCNA、Survivin蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒定量蛋白浓度。加入20 μL样品到每道中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白分离出来后，转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入β-actin、PCNA、Survivin一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜，再分别与相应的二抗结合，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3×10 min。采用Image J软件分析目的条带与β-actin的灰度值，以目的条带与β-actin灰度值的比值计算目的蛋白相对表达量。

1.6 细胞中PCNA、Survivin mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取逆转录产物进行实时荧光定量PCR。PCNA上游引物5′-GGCGCTAGTATTTGAAGCACCA-3′,下游引物5′-GGCATATACGTGCAAATTCACCA-3′；Survivin上游引物5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′，下游引物5′-AGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′；β-action上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR反应条件：95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；55 ℃ 10 s，81个循环。以2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以x±s表示，符合正态分布的数据多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较采用独立t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 ICA高浓度组细胞增殖抑制率较中、低浓度组升高，中浓度组较低浓度组升高(P均<0.05)；ICA低、中、高浓度组细胞增殖抑制率72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较(%，x±s)

注：与ICA低浓度组比较，aP<0.05；与ICA中浓度组比较，bP<0.05；与同组24 h比较，cP<0.05；与同组48 h比较，dP<0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组细胞凋亡率为1.08%±0.19%，ICA低、中、高浓度组细胞凋亡率分别为8.25%±1.32%、18.26%±1.51%、36.08%±7.01%。ICA组细胞凋亡率较对照组升高，高浓度组较中、低浓度组升高，中浓度组较低浓度组升高(P均<0.05)。

2.3 各组细胞PCNA、Survivin蛋白表达比较 ICA中、高浓度组细胞PCNA、Survivin蛋白表达低于对照组(P均<0.05)，ICA低浓度组与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组细胞PCNA、Survivin蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4 各组细胞PCNA、Survivin mRNA表达比较 ICA低、中、高浓度组PCNA、Survivin mRNA表达水平均低于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组细胞PCNA、Survivin mRNA表达比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

由于SACC对放化疗均不敏感，因此目前临床上仍以手术治疗为主，强调在尽量少影响功能的基础上对肿瘤进行彻底切除，并在术后给予局部适量的放疗以提高疗效，而化疗则常作为处理其复发症状的措施。然而放疗和化疗都具有一定的不良反应，放疗可导致患者乏力、过敏、脱发、造血功能下降等，化疗可以导致局部组织坏死、静脉炎、骨髓抑制、胃肠毒性、免疫抑制、肾毒性等。有研究证实，ICA可以减少放化疗的不良反应。葛林阜等[4]在小鼠接受60Co照射后给予ICA，检测外周血白细胞总数及分类、骨髓和脾脏粒细胞、巨噬细胞克隆形成单位(CFU-GM)计数变化，发现ICA可促进小鼠外周血白细胞总数增加，增加骨髓和脾脏粒细胞、巨噬细胞CFU-GM集落形成，说明ICA具有明显的促进血液功能恢复的作用。赵连梅等[5]通过腹腔注射环磷酰胺建立C57BL/6j小鼠免疫抑制模型，检测灌服ICA的免疫抑制小鼠脾脏和胸腺指数、淋巴细胞数量、淋巴细胞增殖反应等各项免疫指标，结果显示，ICA提高了免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指数，促进了免疫抑制小鼠免疫细胞的增殖和成熟，提示ICA能促进小鼠免疫功能，具有逆转化疗后小鼠免疫抑制状态的作用。

细胞凋亡是一个多因素参与的生理过程，涉及到免疫应答、基因调控、信号传导等多种过程[6]。细胞凋亡在多种正常生理过程中可起到调节作用，若此功能出现异常或缺失则可导致一系列病理情况发生。肿瘤细胞的特征之一就是缺乏这种程序性的死亡过程，而抗肿瘤中药可以诱导这种程序性死亡，从而达到治疗肿瘤的目的[7]。本研究结果显示，采用不同浓度的ICA处理SAAC-M细胞24、48、72 h后，高浓度组细胞增殖抑制率较中、低浓度组升高，中浓度组较低浓度组升高；ICA低、中、高浓度组细胞增殖抑制率72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h。ICA不同浓度组细胞凋亡率均较对照组升高，高浓度组较中、低浓度组升高，中浓度组较低浓度组升高。说明ICA具有抑制SACC-M细胞增殖和促进其凋亡的作用。

SACC的增殖、凋亡、侵袭、转移是由多种基因及其表达产物共同参与的过程，其中相关基因在调节细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤转移以及细胞黏附、细胞迁移、血管生成等生理活动中起重要作用。PCNA为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与细胞增殖过程中DNA的复制，反映细胞增殖活性，可作为判断细胞增殖状态的一项指标。PCNA可调节G1期细胞进入S期，参与DNA复制过程所需的聚合酶的合成，其水平高低与细胞增殖速度密切相关[8，9]。研究证实，PCNA参与了中枢神经系统肿瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发生发展[10，11]。李伟等[12]认为，胃癌组织分化愈差，PCNA强表达率愈高，增殖活性愈高。本研究结果显示，ICA中、高浓度组细胞中PCNA mRNA及蛋白表达高于对照组，表明ICA抑制SACC-M细胞增殖的作用可能与下调PCNA的表达有关。

Survivin位于人染色体17q25上，是目前所知最强的凋亡抑制蛋白。除胚胎组织外，几乎所有正常组织中均未检测到Survivin，但Survivin在胃癌、肺癌、甲状腺癌组织中高表达[13～15]，且与肿瘤细胞的凋亡密切相关。本研究结果显示，ICA不同浓度组细胞中Survivin mRNA及蛋白表达均高于对照组，表明ICA促进SACC-M细胞的凋亡可能与下调Survivin的表达有关。

综上所述，在一定浓度和时间范围内，ICA能够阻止SACC-M细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能与PCNA、Survivin表达下降有关。