慢性疲劳综合征中学生运动前后尿液差异代谢物的比较*

池爱平， 王子楠， 史 兵， 杨小帆， 闵瑞欣， 宋 婧

(陕西师范大学体育学院， 西安 710119)

慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome，CFS)属于一种重度的亚健康状态，是一组以长期持续疲劳为突出表现，同时伴有以注意力不集中、记忆力下降、低热、头痛、咽喉痛、肌肉关节痛、睡眠障碍和抑郁等非特异性表现为主的一组征候群[1]。长期的工作学习压力、精神压力、睡眠不足、运动不足、性格内向以及人际关系不和谐等多种原因都是CFS的诱因。目前国际上诊断CFS的依据是美国疾病控制中心1994年(CDC-1994)修订的标准。该标准主要包括：持续或反复出现6个月及以上、非劳累引起的严重疲劳，经休息后不能缓解；并且在下列8项症状中至少满足4项：(1)短时记忆力下降或注意力难以集中，(2)咽喉痛，(3)颈部或腋窝淋巴结肿大，(4)肌痛，(5)多发性关节痛，(6)头痛，(7)睡体体，正处于生长发育的关键时期，同时面临升学压力和长期、紧张的学习生活节奏，极易成为CFS群体。CFS会导致青少年记忆力减退、学习成绩下降，严重影响其身体发育与体质健康。此外研究还显示，CFS如能得到及时诊治，其康复的可能性就较大；但持续时间越长越难治愈，可对患者的身体和心理健康造成不可估量的危害，最终导致器质型疾病的发生[2]，而且CFS还可导致机体在大强度运动后猝死[3]。可见CFS对青少年群体的危害不容忽视。对青少年CFS群体进行监测与防治，是目前青少年健康管理与促进的任务之一。青少年CFS有别于成人，具有自己的特点，根据其症状的复杂性，诊断时要考虑许多变异。研究发现，易疲劳、头痛、睡眠障碍、情绪问题、对声音敏感和认知困难是青少年CFS的常见症状[4]。

代谢产物能够在一个生物体的细胞器、细胞、组织、器官、体液等各个层面上产生[5]，从某种意义上说，机体的每一项生命活动都要受到代谢产物的调节和影响。代谢组学是一种研究体内代谢产物的系统生物学方法，重点考查的是机体内分子量在1000D以内的小分子代谢物质。对于CFS人群而言，代谢组学研究可以筛选其特异性标志物，探索其发病机制。在代谢物的选择上，由于尿液采样方便、对机体无损伤，常作为许多疾病诊断的目标物[6]。此外，运动后人体生理功能的变化和代谢系统的变化均较安静时更明显，此时检测机体的生理功能和代谢标志物往往能获得很多潜在的生物指标变化特征[7]。本研究旨在探析中学生CFS的代谢机制，为进一步完善CFS的生物学检测标准提供理论依据。由于CFS可导致机体在大强度运动后猝死[8]，本研究采用中等强度的哈佛台阶运动作为运动干预方式，以确保受试者安全[9]。

1 对象与方法

1.1 研究对象

为了尽可能降低外界因素对差异代谢物检测的影响，本实验选取符合CDC-1994诊断标准的某高中8名全封闭管理的高三学生作为试验组(CFS组)，同时选取8名同年级同性别的健康学生作为对照组。针对哈佛台阶实验的操作特点，受试对象全部为男性，学生基本情况见表1。

GroupAge(y)Height(cm)Weight(kg)Control18±1173.36±4.2170.63±6.92CFS18±1172.54±3.9871.54±5.81

1.2 运动方式与尿液采集

受试者均为本地高三补习学校学生，测试前3天统一其作息、饮食，不允许吸食烟酒以及其他刺激性食物，并且避免参加体育活动。测试当天早晨，采集受试者的中段晨尿2 ml；下午3点进行中等强度的哈佛台阶实验，上下台阶踏步频率为70次/min。考虑到在中等强度运动中，参与物质代谢的主要有磷酸原、糖和氨基酸三个代谢系统，其代谢产物进入血液最终形成尿液成分的时间为2～3 h[10]，因此第二次采集尿样时间设定为运动后3 h，采样量2 ml。采集的尿液样本置于液氮灌中，随后转存于-80℃低温冰箱待测。

1.3 样品的LC-MS法检验

在室温下融化尿液样品，吸取100 μl至1.5 ml离心管中，加入300 μl甲醇，涡旋震荡充分混匀，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取200 μl上清用于LC-MS检测。仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS (Agilent,1290 InfinityLC, 6530 UHD和Accurate-Mass Q-TOF/MS)；分离色谱柱为C18色谱柱(Agilent, 100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；色谱分离条件为：柱温40℃；流速0.35 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。质谱条件：采用正离子模式进行；检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型。正离子模式条件为：毛细管电压4 kV、锥孔电压35 kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气600 L/h、萃取锥孔4 V。

1.4 数据的多维统计分析

参考相关文献[11-15]，对所得到的各组样品的质谱数据，进行主成分(principal component analysis，PCA)分析。以此来获得得分矩阵图(score scatter plot)和加载矩阵图(loading scatter plot)。根据加载矩阵中各变量对主成分贡献的大小可以判断生物标志物。为排除干扰因素，获得更准确的数据，对PCA分析完的数据再次进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，以过滤除去无关数据，得到可靠的差异代谢物数据。同时统计对模型进行置换检验，以此验证所建立的模型是否符合样本数据的真实情况。

1.5 数据处理

经过LC-MS法检测之后，利用SIMCA软件(V14, Umetrics AB, Umea, Sweden)对归一化后的数据进行多元变量模式识别分析。对样本进行主成分分析能从总体上反映各组样本之间的总体差异和组内样本之间的变异度大小。采用PCA、OPLS-PA多维统计处理，以差异代谢物对本组的贡献值(variable importance in the projection，VIP)和t-检验概率值P作为差异代谢物的筛选指标，即VIP>1且P<0.05作为标准筛选潜在的差异代谢物。所有化合物都通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行潜在的生物标志物的筛选，再将筛选出来的生物标志物输入MetPA数据库(http://metpa.metabolomics)中，分析相应的代谢通路。

2 结果

2.1 LC-MS法检测的质谱图分析

将对照组和CFS组的所有样品混合在一起，得到两组的LC-MS总离子流重叠色谱图(TIC)，如图1所示。

图1是在正离子模式下取得的对照组和CFS组混样LC-MS总离子流的重叠色谱图。结果表明，两组共检测到1491个物质峰。从对照组(图1A)和CFS组(图1B)的总离子流的重叠色谱图来看，两组的物质峰群存在较大的差异，说明CFS组学生与对照组学生的尿液代谢物中存在较多的差异代谢物。因此，有必要对其作进一步分析。另外，两组总离子流重叠色谱图的物质峰都非常整齐，保留时间重现性非常好，说明本研究采用的LC-MS仪器稳定性较高，分析和数据结果的可靠性非常高。

Fig.1Total ion chromatograms of the urine samples obtained from the subjects in chronic fatigue syndrome (CFS) and control groups.

A: Control group; B: CFS group

2.2 PCA和OPLS-DA分析结果

运动前后CFS组学生与对照组学生尿液代谢物的PCA和OPLS-DA分析结果如图2所示。

Fig.2Principal componentanalysis (PCA) and orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis (OPLS-DA) of urine metabolitesfrom the subjects in CFS and control groups

A: Pre-exercise (a: PCA score; b: OPLS-DA score); B: Post-exercise (a: PCA score; b: OPLS-DA score)

图2A表示运动前CFS组与对照组的PCA和OPLS-DA得分结果比较，图2B表示运动后CFS组与对照组的PCA和OPLS-DA得分结果比较。图中每个点代表一个样品，样品在图中的坐标由其所包含的成分决定，也就是样品分布的差异由其成分的差异决定。不管是运动前还是运动后，CFS组和对照组样本分布在各个象限，表明只靠PCA分析不能达到明显的分离效果，需要对样本进一步采用有监督方式的OPLS-DA进行分析。通过OPLS-DA过滤掉不相关的正交信号，因而获得的差异性代谢物更加可靠。从OPLS-DA得分图可看出，运动前与运动后的组间样本对比中，对照组样本分布在Ⅱ、Ⅲ象限，而CFS组样本分布在Ⅰ、Ⅳ象限，两组样本分布非常整齐，分离效果非常明显。OPLS-DA得分能够很好地反映出组内尿液的相似性和组间样品的差异性，说明不论运动前还是运动后，CFS组学生尿液代谢物与对照组学生尿液代谢物存在较大的差异。

2.3 潜在差异代谢物的筛选

通过OPLS-DA分析，CFS组与对照组所有化合物都通过KEGG数据库进行差异代谢物筛选。筛选结果必须同时满足以下3个条件：(1)差异代谢物对本组的贡献值VIP大于1；(2)与KEGG数据库对应物质的相似度大于700；(3)与对照组比较，CFS组差异代谢物含量具有显著性差异(P<0.05)。满足上述条件的差异代谢物才能最终入选。最终结果显示，运动前CFS组筛选得到4个差异代谢物，分别是肌酸、吲哚乙醛、植物鞘氨醇和焦谷氨酸(表2)。这4个代谢物依次涉及到精氨酸-脯氨酸代谢、色氨酸代谢、鞘脂类代谢和谷胱甘肽代谢。同样，与对照组比较，运动后CFS组得到11个差异代谢物，依次是壬二酸、甲基腺苷、乙酰肉碱、癸酸、皮质酮、肌酸、左炔诺孕酮、泛酸、焦谷氨酸、黄嘌呤核苷和黄尿酸，这些差异代谢物主要与氨基酸代谢、能量代谢、类固醇激素生物合成和嘌呤代谢等相关。

Tab. 2 Differential metabolites of CFS students before and after exercise

a(↑): Up-regulated; (↓): Down-regulated

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.4 代谢通路分析

将检出的15个差异代谢物(表2)输入MetPA数据库，对其所涉及的代谢通路进行权重分析。以得分>0.01为阈值，对这些代谢通路进行筛选，高于此值为CFS的潜在靶标通路。图3结果显示，与对照组比较，运动前CFS组的代谢紊乱与精氨酸-脯氨酸代谢紊乱相关(图3A)。在运动后的对比中，CFS组除了精氨酸-脯氨酸代谢紊乱依然存在之外，又检测到泛酸与辅酶A生物合成、类固醇激素生物合成两条代谢通路存在障碍(图3B)。

3 讨论

慢性疲劳综合征是一种较为严重的持续性疲劳，患者的症状主要有乏力、身体某些部位疼痛、记忆认知能力下降以及抗病能力差等。研究报道显示，CFS的这些症状与能量代谢紊乱[16]、免疫功能紊乱[17]以及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能减退等有关[18]。本课题组前期建立了CFS动物模型，探索了CFS发病的代谢机制，我们的研究结果显示：CFS机体的代谢障碍主要发生在三羧酸循环、谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸代谢、类固醇生物合成三条代谢通路上[19]。为了验证基础研究的结果，本次经过严格筛选与控制，对8名CFS中学生进行了代谢障碍机制的探索。该群体学习压力与思想压力都很大，同时存在睡眠不足或睡眠质量差等问题，进而影响其认知与记忆能力，导致学习成绩下降。

Fig.3Impact score of the metabolic pathways of CFS students in pre- and post-exercise

A: Pre-exercise (a: Arginine and proline metabolism); B: Post-exercise (a: Arginine and proline metabolism; b: Biosynthesis of pantothenate and CoA; c: Steroid hormone biosynthesis)

本研究采用LC-MS法，对CFS中学生运动前后采集的尿液进行系列检测与数据分析。结果表明，在非运动状态下，CFS组的代谢紊乱只与精氨酸-脯氨酸代谢紊乱相关；而在运动后，CFS组除依然存在精氨酸-脯氨酸代谢紊乱外，还与泛酸与辅酶A生物合成、类固醇激素生物合成两条代谢通路障碍有关。本次研究结果与前期研究结果均证实，CFS机体存在类固醇生物合成降低现象，这与该代谢通路中的关键差异代谢物皮质酮含量的减少有关。已有研究证实，CFS患者皮质酮含量下降是由于其HPA轴功能紊乱所致[18,20]。皮质酮是HPA轴分泌的主要类固醇激素之一，对人体免疫能力、认知能力、学习能力以及记忆能力有影响[21]。因此CFS组中学生表现出的注意力无法集中或记忆力减退现象，可能与HPA轴功能紊乱有关。

而与动物模型不同的是，本次研究结果显示CFS组中学生的另外两个代谢系统出现障碍，即精氨酸-脯氨酸代谢、泛酸-辅酶A生物合成。上述两个代谢通路中的关键差异代谢物依次为肌酸和泛酸。肌酸在肌肉能量代谢中起着重要的作用，可以储存或补充ATP[22]。CFS患者体内ATP含量较低是其感到乏力的原因之一。泛酸是辅酶A生物合成的前体物质，后者参与生物体内的糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢，也影响肾上腺皮质的机能和能量代谢。泛酸含量降低会影响机体的抵抗力[23]。本研究结果显示，CFS组中学生运动后体内的泛酸含量显著低于对照组，进而导致其能量代谢水平下降，运动能力降低。本研究结果显示，CFS组中学生的台阶指数显著低于对照组，这可能与其机体差异代谢物肌酸和泛酸显著降低有关，进而导致其精氨酸-脯氨酸代谢紊乱和泛酸-辅酶A生物合成受阻。

综上所述，精氨酸-脯氨酸代谢紊乱是CFS的代谢紊乱机制之一；除此之外，在给CFS中学生施加一个中等强度的运动后，能够检测出另外两个代谢通路障碍，即类固醇激素代谢障碍、泛酸-辅酶A生物合成障碍。肌酸、皮质醇和泛酸是CFS患者的潜在生物标记物。上述结果为进一步探索CFS中学生临床症状的生理和病理机制提供了理论依据。