马铃薯松散型愈伤组织再生体系的建立

张丹妮　刘艳军　李建科　蒲思宜　汪永庆　黄俊轩　杨静慧　武春霞

摘 要：为了建立松散型愈伤组织再生体系，试验采用马铃薯茎段为外植体，在含有不同激素的培养基上诱导出愈伤组织，再将诱导出的愈伤组织转接到含有不同激素的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导，将诱导出的松散型愈伤组织转接到再生培养基上进行再生芽的诱导，从中筛选出再生效果最好的培养基配方。结果表明，在MS+2 mg·L-1 2，4-D的培养基上获得的愈伤组织生长效果最好；在MS+1 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D的培养基上可以获得理想的松散型愈伤组织，马铃薯松散型愈伤组织在MS+0.5 mg·L-1 KT培养基上诱导后可以获得较高的再生率。

关键词：马铃薯；愈伤组织；培养基；再生

中图分类号：S532 文献标志码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.017

Abstract： To establish a regeneration system of potato loose callus， the stem segments were used as explants to induce callus on medium containing different hormones. The induced callus was then transferred onto the medium containing different hormones to induce the loose callus. The induced loose callus was transferred to the regeneration medium for regeneration bud induction， and the best regeneration medium was screened out. The results showed that the callus induced by MS+2 mg·L-1 2，4-D medium had the best growth， the ideal loose callus was obtained from MS+1 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D medium， and the high regeneration rate was obtained when the potato loose callus was cultured on MS+0.5 mg·L-1 KT medium.

Key words：potato； callus； medium； regeneration

愈傷组织是一种特殊的细胞，是植物在伤口部位形成的一种起到保护作用的薄壁细胞，因为愈伤组织体系稳定，细胞之间差异较少，很容易获得均一的细胞环境，可以进行遗传、生理生化等相关研究[1]。有关愈伤组织的研究报道很多，多集中于诱导愈伤组织和愈伤组织离体再生的研究等方面[2-7]。

马铃薯是重要的粮食作物，关于马铃薯愈伤组织研究的报道很多。马铃薯愈伤组织具有多种用途：一是通过愈伤组织离体诱变技术进行种质资源创新研究[8-11]，获得优良的种质资源，为马铃薯的育种提供优良性状；二是通过愈伤组织快速培养技术，可以脱除组织中的一些通过维管组织传播的病毒[12-16]，从而建立快速、高效的马铃薯脱毒体系；三是建立马铃薯组培快繁体系，为生产上提供大量的优质种苗；四是可以通过马铃薯愈伤组织体系进行相关的科学研究。目前，有关马铃薯愈伤组织的研究多集中在质地紧密型愈伤组织的诱导及再生，这种愈伤组织在诱变育种、脱毒和快繁等方面效率较低，这就需要建立新型的马铃薯愈伤组织再生体系。

本研究通过诱导出马铃薯松散型愈伤组织，再诱导愈伤组织再生，建立马铃薯松散型愈伤组织离体再生体系，旨在提高愈伤组织在各种应用中的效率，为马铃薯产业发展奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试植物材料马铃薯组培苗由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 马铃薯愈伤组织初步诱导培养基的筛选 在超净台中剪取马铃薯组培苗茎段，每个茎段不带腋芽，只取2个叶片之间的部分。将剪好的马铃薯茎段外植体接种到事先配制好的愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织初步诱导培养基采用MS为基本培养基，附加0.5，1.0，2.0，3.0 mg·L-1 2，4-D，另外附加30 g·L-1的蔗糖和7 g·L-1的琼脂粉，pH值调节到5.8，置于组培室中进行愈伤组织的诱导培养。培养条件：温度25 ℃，24 h连续光照，光照强度1 000 lx。接种后每天观察茎段外植体伤口部位的变化，30 d时统计每个处理愈伤组织诱导情况。

1.2.2 马铃薯松散型愈伤组织诱导培养基的筛选 将1.2.1中诱导出的愈伤组织从外植体上切下，分割成大小3 mm的小块，将切分好的愈伤组织块接种到事先配制好的培养基上。培养基的配制与1.2.1相同，是MS基本培养基中添加不同浓度的BA、KT和2，4-D，置于组培室中培养，培养条件也与1.2.1相同。

1.2.3马铃薯愈伤组织再生体系的建立 将1.2.2诱导出的马铃薯松散型愈伤组织在超净台中分割成直径为3 mm的小块，分割时注意不要使愈伤组织分散开。不同再生培养基的配制过程与1.2.2相同。将愈伤组织接种到事先配制好的再生培养基上。培养条件与1.2.2相同，只是光照强度提高到2 000 lx。接种后观察愈伤组织的变化，40 d后统计每个处理愈伤组织再生的情况。

2 结果与分析

2.1 马铃薯愈伤组织初步诱导培养基的筛选

从表1可以看出，在2，4-D浓度为0.5 mg·L-1时，所有外植体均没有获得愈伤组织，只是在伤口部位长出一些不定根，这是由2，4-D的使用浓度不够、外植体内源生长素较高造成的；在2，4-D浓度为1.0 mg·L-1时，可以诱导出少量愈伤组织，但愈伤组织生长速度较慢；当2，4-D浓度为2.0 mg·L-1时，愈伤组织诱导率明显增加，愈伤组织的生长速度较快，诱导出的愈伤组织为白色、质地较硬的愈伤组织类型；当2，4-D浓度达到3.0 mg·L-1时，愈伤组织诱导率降低、生长速度减慢，且质地变软，甚至在培养后期出现褐变现象，说明2，4-D的使用浓度过高，对愈伤组织造成了毒害作用。由此可见，在MS培养基中添加2.0 mg·L-1 2，4-D进行初步诱导，可以获得较理想的愈伤组织。

2.2 马铃薯松散型愈伤组织的诱导培养基筛选

从表2可以看出，与BA+2，4-D组合相比较，KT+2，4-D组合的各处理均可使愈伤组织生长速度加快，说明KT较BA更适合马铃薯愈伤组织的诱导。采用BA与2，4-D配合使用时，其比值不同，对愈伤组织生长及形态影响不同，在比值较低（0.5和1.0）时，愈伤组织为紧密型，质地较软，说明2，4-D的作用较大，愈伤组织细胞生长迅速，多由巨大型的大液泡细胞组成；当比值增大至2.0时，愈伤组织质地变硬，结构变得松散，但也从透明、半透明状变成褐色，说明BA对愈伤组织产生了毒害作用。采用KT与2，4-D配合使用时，各处理愈伤组织均可快速生长，且随着KT与2，4-D比值的增加，愈伤组织质地逐渐变硬，结构变得松散。由此可见，根据愈伤组织生长情况，理想的松散型马铃薯愈伤组织诱导培养基为：MS+1.0 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D。

2.3 马铃薯再生体系建立

从表3可以看出，培养基中不添加激素，愈伤组织也能够再生，虽然再生率较低，但生长正常，說明此时的松散型愈伤组织基本处于胚性化，可以在没有激素的培养基上再生出芽，但由于内源生长素水平较高，再生芽生长受到抑制，可在培养基中添加一定量的分裂素，对生长素起到一定的中和作用，以促进再生芽的生长。在培养基中加入0.5 mg·L-1 2，4-D的基础上，加入1.0或2.0 mg·L-1 KT，均无任何愈伤组织再生出芽，说明2，4-D对愈伤组织再生有一定的抑制作用。在培养基中加入0.5或1.0 mg·L-1 KT，可以获得较高的愈伤组织再生率，其中0.5 mg·L-1 KT可获得最高再生率且生长正常，而1.0 mg·L-1 KT再生率下降、生长缓慢且长势弱，说明KT浓度高亦会抑制再生。由此可见，选择MS+0.5 mg·L-1 KT培养基可以获得理想的再生效果。

3 结论与讨论

愈伤组织形态可以通过激素来调节，有研究认为，激素改变了愈伤组织中各种细胞的组成比例，从而导致愈伤组织的整体性质发生变化，最终产生不同类型的愈伤组织[17-22]。一般来说，愈伤组织是由薄壁细胞构成，主要有2种，一为分裂能力强、细胞质浓、个体小的细胞，其数量增加可使愈伤组织质地变硬；二为巨大型的大液泡细胞，这类细胞组成的愈伤组织质地软，不利于再生诱导[23]。愈伤组织结构主要取决于以上2种愈伤组织细胞的比例，适当的混合2种细胞可以使得愈伤组织结构松散，相反，增加巨大型的大液泡细胞愈伤组织变软，最后解体死亡，而增加分裂旺盛的小细胞数量就会使得细胞连接紧密，形成紧密型愈伤组织，因此适当调节二者的比例使之分布均匀，才能控制愈伤组织结构，使之变得松散。除了通过激素的调节影响愈伤组织类型，还可以通过改变培养条件或在继代培养有目的取舍，对愈伤组织形态与类型的诱导产生重要影响。

在本研究中，首先采用2，4-D进行马铃薯愈伤组织的诱导，通过改变2，4-D的浓度可以诱导出一定的愈伤组织，然后通过调整培养基中的分裂素与2，4-D之间的比例，可以改变愈伤组织的类型。通过试验结果的优化，建立了高效马铃薯松散型愈伤组织再生体系，具体步骤如下：采用马铃薯茎段为外植体，在MS+2 mg·L-1 2，4-D的培养基上诱导出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织转接到MS+1 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1 2，4-D的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导；将诱导出的松散型愈伤组织转接到MS+0.5 mg·L-1 KT再生培养基上进行再生芽的诱导，整个过程需要40 d即可诱导出马铃薯再生芽。

参考文献：

[1]钟宇，张健，罗承德，等. 西洋杜鹃组织培养技术体系研究[J]. 四川农业大学学报，2001，19（2）： 141-143.

[2]黄娟， 吴鹏飞， 程浩，等. 杉木愈伤组织的继代增殖与植株再生[J]. 森林与环境学报， 2018， 38（1）： 20-26.

[3]申雯靖， 赵欢，张盛圣， 等. 金钻蔓绿绒愈伤组织诱导及再生体系的建立[J]. 分子植物育种， 2017， 15（11）： 4573-4577.

[4]于妍， 胡楠楠， 侯杰， 等. 玉米组织培养及再生体系的建立[J]. 乡村科技， 2017（32）： 68-69.

[5]蔡阳光， 张文慧， 陈国爱， 等. 不同激素对杂交魔芋愈伤诱导及植株再生的影响[J]. 热带农业科学， 2017， 37（10）： 1-5， 11.

[6]朱向涛， 王雁， 吴倩， 等. 江南牡丹茎段愈伤组织诱导与植株再生[J]. 核农学报， 2015， 29（1）： 56-62.

[7]周宇晴， 张俊杰， 韦雪芬， 等. 任豆叶片的愈伤组织诱导和植株再生[J]. 植物生理学报， 2017， 53（9）： 1659-1665.

[8]周海成， 刘艳军， 黄俊轩，等. 冰灯玉露离体诱变技术[J]. 天津农业科学， 2017， 23（7） ：25-28.

[9]蒋姝， 孟金贵， 崔光芬， 等. 植物离体诱变及在百合育种中的应用[J]. 中国农学通报， 2012， 28（4）： 69-73.

[10]陆柳英， 莫饶， 李开绵. 植物体细胞无性系变异技术的研究进展[J]. 广西农业科学， 2007（3）： 238-243.

[11]吴殿星， 夏英武， 舒庆尧. 辐射诱变和组织培养复合育种技术的研究进展[J].中国农学通报， 1994（6）： 20-22.

[12]史滟滪， 杨静慧， 刘婷， 等. 马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导[J]. 天津农业科学， 2016， 22（12）： 20-23.

[13]李军， 高广春， 李白， 等. 植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用[J]. 生物技术通报， 2014（7）： 44-48.

[14]周权男， 张慧君， 戴雪梅， 等. 植物组织培养在农业生产中的应用研究进展[J]. 北方园艺， 2014（13）： 196-199.

[15]方贯娜， 庞淑敏. 马铃薯愈伤组织再生体系的研究进展[J]. 中国马铃薯， 2012， 26（5）： 307-310.

[16]符国芳， 李青. 植物组织培养脱毒方法综述[J]. 福建林业科技， 2007（3）： 255-258.

[17]夏凯丽， 刘婷， 杨静慧， 等. 黑莓体细胞胚诱导中的细胞生理特性[J]. 中国南方果树， 2018（1）： 114-118.

[18]严小峰， 刘艳军， 黄俊轩， 等. 冰灯玉露松散型胚性愈伤组织的诱导方法[J].天津农业科学， 2017， 23（7）： 21-24， 36.[19]杨静慧， 吴志瑜， 刘艳军， 等. 盐胁迫下耐盐苜蓿松散型愈伤组织生理生化特性变化[J]. 天津农学院学报， 2016， 23（4）： 38-42.

[20]刘艳军， 张超， 杨静慧， 等. 塔杨松散型均质胚性愈伤组织培养体系[J]. 植物研究， 2016， 36（1）： 123-128， 133.

[21]苗博瑛， 刘艳军， 杨静慧. 黑莓松散型胚性愈伤组织的诱导[J]. 山西农业科学， 2014， 42（3）： 209-212， 216.

[22]范丽华， 赖呈纯， 谢鸿根， 等. 福建野生葡萄松散型愈伤组织的诱导及其继代保持[J]. 福建农业学报， 2012， 27（7）： 711-716.

[23]杨静慧，秦艳筠，刘婷，等.两种愈伤组织生理生化特性和形态结构比较[J].天津农业科学，2014，20（8）：22-24.