硝基呋喃类药物及其代谢物检测方法的研究进展

徐伟　耿士伟　刘路　程凤科　还静　孙政国

摘 要：本文介绍了硝基呋喃类药物种类、理化性质及其危害，总结了胶体金免疫、酶联免疫、高效液相色谱和液相色谱串联质谱等目前检测硝基呋喃类药物及其代谢物残留的常用方法研究进展，并对该类药物检测方法的应用提出了相关建议。

关键词：硝基呋喃类药物及代谢物；检测方法；研究进展

中图分类号：O657.63 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.005

Abstract： This paper introduced the species， the physicochemical properties and the harms of nitrofuran antibiotics， summarized the research progress of common methods of gold immunochromatography assay （GICA）， enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）， high performance liquid chromatography（HPLC） and liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）， of the nitrofuran antibiotics and their metabolites residues， and offered some suggestions for the application of drug detection method.

Key words： nitrofuran antibiotics and their metabolites； detection method； research progress

硝基呋喃類药物是一种广谱抗菌药物，由于其价格低廉、抗菌效果好，被广泛应用于畜禽、水产、蜂等动物传染病的预防和治疗，部分品种具有促生长作用，可用作饲料添加剂。但由于该类抗生素是致癌物，引起世界各国普遍关注，并逐步完善对该类药物的控制规定，1990年欧盟颁布的2377/90/EEC条例将硝基呋喃类药物及其代谢物列为A类禁用药物，1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素[1]；美国于1993年禁止呋喃唑酮作为兽药使用[2]，2004年，美国食品和药品管理局（FDA）公布禁止在进口动物源性食品中使用呋喃西林和呋喃唑酮[3]；2002年我国颁布的农业部第193号公告明令禁止使用呋喃唑酮和呋喃它酮，2005年颁布的农业部第560号公告将呋喃妥因和呋喃西林列入首批《兽药地方标准废止目录》。

1 硝基呋喃类药物简介

1.1 药物种类及理化性质

硝基呋喃类药物是呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基团的一类人工合成抗菌药，包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因[4]。由于该类药物都具有C=N双键和5-硝基呋喃环结构，所以四种药物具有相似的理化性质，无臭，味苦，为性质稳定的黄色结晶粉末。对光敏感、代谢快，在动物体内的半衰期不过数小时，但其代谢物（表1[5]）分子可与蛋白质结合形成稳定的蛋白结合物。

1.2 药物作用及其危害

硝基呋喃类药物抗菌机理是干扰细菌体内的氧化还原酶系统，使细菌代谢紊乱[6]，低浓度下对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫有抑制作用，高浓度下有杀灭作用，常用于治疗和预防畜禽及水产类因感染大肠杆菌和沙门氏菌而产生的疾病。呋喃唑酮常被用于治疗原虫或细菌引起肠炎、痢疾、腹泻等肠道性疾病，有“痢特灵”称号；呋喃西林仅用于消毒防腐；呋喃妥因主要用于细菌引起的泌尿系统感染；呋喃它酮在肠道不容易被吸收，主要用于治疗肠道感染[7]。

硝基呋喃类药物的危害主要表现为[8-11]：（1）对畜禽毒性作用。大剂量或长时间应用硝基呋喃类药物均能对畜禽产生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小；（2）具有致癌致畸致突变作用。呋喃它酮为强致癌药物，呋喃唑酮具有中等强度致癌性，可诱发乳腺癌和支气管癌，同时还具有繁殖毒性，并且可以引起细菌突变；（3）代谢物对人体危害严重。该类药物在人体内代谢迅速，而代谢物可长期保持稳定并可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此，当人体摄入含有该类药物残留的食品后，代谢物在胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来危害人体健康。

2 硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测方法

由于硝基呋喃类药物具有对光敏感、代谢快的特点，而代谢物可长期保持稳定，因此，通常以测定代谢物残留量来判断硝基呋喃类药物使用情况。目前，国内外报道的硝基呋喃类药物及其代谢物检测方法主要有胶体金免疫法、酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。

2.1 胶体金免疫法（GICA）

胶体金免疫法（GICA）是一种前处理简单，反应时间短，通过肉眼判断的快速定性检测方法。何方洋等[12]研制了饲料中硝基呋喃抗生素胶体金检测试纸条，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因最低检测限分别达到5，3，2，2 μg·kg-1，假阳性率为2%，假阴性率为0。李军等[13]研发的试纸条可检测8种硝基呋喃类药物，检测限范围为0.2～0.8 μg·g-1。张晓丽等[14]制备了AMOZ胶体金试纸条，灵敏度为5 μg·L-1，样品前处理完成后只需3～5 min可观察结果。徐向霞等[15]研制的用于检测猪肉中AHD试纸条检测限为2.33 μg·L-1，整个检测流程不超过5 min。赵正苗等[16]应用GICA法检测鸡肉、猪肉、鱼、虾中SEM，检测限为1.0 μg·kg-1，假阴性率为0，假阳性率小于5%。柳爱春等[17]建立了水产品中4种硝基呋喃代谢物GICA法，研制了免疫胶体金快速检测试剂盒，对AOZ最低检出限为0.5 μg·kg-1，对AMOZ、AHD和SEM最低检出限为1.0 μg·kg-1，其检测结果通过LC-MS/MS法确证，符合率为98%。

2.2 酶联免疫法（ELISA）

酶联免疫法（ELISA）是一种特异性较强、灵敏度高的半定性定量的检测法，操作简便、检测时间短，可实现大批量样品同时检测，因此常作为筛选方法用于药物残留分析。2004年，Cooper等[18]首次制备得到了AOZ的多隆抗体，并提出了虾组织中AOZ检测的ELISA法，该方法的建立为硝基呋喃代谢物的ELISA检测法发展奠定了基础。之后，Cooper等[19]又报道了SEM的ELISA檢测法，检测限为0.21 μg·kg-1，定量限为0.25 μg·kg-1。Pimpitak等[20]建立的AMOZ的ELISA检测法的检测限为0.16 μg·kg-1，定量限为0.2 μg·kg-1。Jiang等[21]报道的AHD的ELISA法，检测限低于0.2 μg·kg-1。以上4种方法的建立，都是间接法测定代谢物含量，即通过检测代谢物的衍生物来确定样品中代谢物的含量。2012年，Yan等[22]首次提出了肉类中AMOZ的ELISA检测法，检测限可达到0.4 ng·g-1，回收率为85.0%～103.0%。在国内，罗杰、李健[23]建立了水产品呋喃唑酮间接竞争ELISA检测法，最小检测限为1 ng·mL-1。徐一平等[24]建立了AHD的ELISA检测法，检测限为0.085 mg·mL-1，并通过猪肉样品添加回收率的测定，证明了该方法的准确性。现在市场如德国R-Biopharm、英国RANDOX等公司均有成熟的产品。

2.3 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是检测硝基呋喃类药物及其代谢物的常用方法之一。2001年农业部农牧发[2001]38号[25]文件中发布的呋喃唑酮的液相色谱-紫外检测器（LC-UV）检测方法，在鸡的肌肉组织、肝脏、肾脏和鱼肉中的检测限分别为10，50，50，25 μg·kg-1，回收率分别为80%～110%，60%～130%，50%～140%，70%～120%。农业部1486号公告-8-2010[26]中使用LC-UV同时检测饲料中4种硝基呋喃类药物，检测限均为0.3 mg·kg，定量限均为1.0 mg·kg-1。贾涛[27]使用乙腈提取，浓缩后用2%甲酸复溶，经混合型阳离子交换柱净化，通过液相色谱-二极管阵列检测器检测饲料中硝基呋喃类药物，发现以365 nm为检测波长时，4种物质峰形最好，检测限达到150 μg·kg-1，当添加浓度为1 mg·kg-1时，平均回收率（n=6）在80.9%～86.5%，符合化合物痕量分析的准确度要求。葛宝坤等[28]采用固相萃取（SPE）前处理净化技术，建立了鸡肉、鱼、虾中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮药物LC-UV测定法，3个不同水平的添加回收率（n=7）为87%～102%，检出限分别达到5，2，3，5 μg·kg-1。于慧娟等[29]通过LC-UV法测定水产品中呋喃唑酮的残留量，检测限可达到1 μg·kg-1。Angelini等[30]利用LC-UV方法检测牛肌肉中4种硝基类药物，检测限和定量限分别达到1 μg·kg-1和2 μg·kg-1。

由于呋喃结构的紫外光谱吸收不明显，导致灵敏度降低，不能达到检测要求，但经衍生化后，硝基呋喃类代谢物可产生较强的紫外吸收，使其检测限提高到1 μg·kg-1。王媛等[31]通过将样品酸解，2-氯苯甲醛衍生后用乙酸乙酯萃取，SPE柱净化，建立了水产品中4种硝基呋喃类代谢物的检测方法，在5.0～500 μg·L-1质量浓度范围内呈现良好的线性关系，定量限为1.0 μg·kg-1，在2个添加浓度水平的平均回收率为76%～102%，相对标准偏差均小于10%（n=6）。Chumanee等[32]采用2-萘甲醛衍生化方法，通过液相色谱-二极管阵列检测器检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物，检测限达到1 μg·kg-1。

2.4 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）

LC-MS/MS法因其具有灵敏度高、检测限低、抗干扰能力强、定性定量准等特点，所以被广泛应用于硝基呋喃代谢物检测和确证。我国针对不同基质背景样品中硝基呋喃代谢物检测发布了各种检测标准，如GB/T 20752-2006、GB/T 21166-2007、GB/T 21311-2007、农业部781号公告-4-2006、农业部1077号公告-2-2008等，其最低检测限均小于或等于0.5 μg·kg-1，均低于欧盟规定的1 μg·kg-1的最低检测限量要求。2001年Alexander等[33]提出了用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法分析动物肌肉组织中4种硝基呋喃代谢物的方法，通过酸性水解、2-硝基苯甲醛衍生和固相萃取净化等步骤，呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的检测限分别是0.5，0.5，3.0，5.0 ng·g-1，定量限分别是2.5，2.5，10.0，10.0 ng·g-1。Pascal等[34]建立的肉中4种代谢物的HPLC-MS/MS检测法，内标法定量，最低检测限为0.11～0.21 μg·kg-1，定量限为0.19～0.36 μg·kg-1。在国内，2003年彭涛等[35]利用 HPLC-MS/MS法测定动物肌肉中四种代谢物残留量，AOZ和AMOZ检测限达到0.05 ng·g-1，定量限达到0.1 ng·g-1，SEM和AHD检测限为0.1 ng·g-1，定量限为0.5 ng·g-1，在添加浓度0.5～10 ng·g-1范围内，平均回收率为60%～95%。余建新等[36]建立的蜂蜜和水产品中4种硝基呋喃代谢物HPLC-MS/MS方法中检测限可达到0.02～0.3 ng·g-1，回收率为79.0%～95.6%。

随着超高效液相色谱（UPLC）的普及应用，加上内标物可降低基质效应对定量结果的影响，一些学者将两者相结合，建立了不同样品中硝基呋喃代谢物UPLC-MS/MS方法，提高了检测灵敏度和准确度，节省了测定时间。廖妍俨等[37]建立了动物源性食品中4种硝基呋喃代谢物的UPLC-MS/MS方法，检出限均为0.25 μg·kg-1，回收率为81.6%～97.3%。尹晖等[38]开发的鸡蛋中硝基呋喃代谢物检测方法，简化了前处理过程，对净化步骤进行了优化，检测限均为0.25 ng·g-1，在0.5～5 ng·g-1添加浓度范围内，平均回收率为79.1%～109.4%。刘柏林等[39]利用UPLC-MS/MS法同时检测猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类及虾类）中4种硝基呋喃代谢物，SEM和AHD最低检出限为0.1 μg·kg-1、AOZ和AMOZ最低检出限为0.05 μg·kg-1，平均回收率在91.8%～107.0%之间。华正罡等[40]针对鸡肉中硝基呋喃代谢物建立的UPLC-MS/MS检测法，AOZ、AMOZ、SEM和AHD最低检出限可达至0.005，0.005，0.01，0.01 μg·kg-1，平均回收率稳定在92%～95%，进一步降低了检出限，提高了准确度。

3 结 论

目前，用于硝基呋喃类抗生素及其代谢物检测的方法主要有胶体金免疫法、酶联免疫法、液相色谱及其串联质谱法。液相色谱法的优点是自动化和精确度高，但受基质效应干扰容易出现假阳性，且仪器昂贵，操作繁琐、前处理复杂，需要专业分析人员。液相色谱-串联质谱法特异性更强，灵敏度和精确度更高，检测限更低，但也存在成本高、操作复杂的缺点。酶联免疫法和胶体金免疫法具有快速、简便、灵敏、高特异性等优点，但无法进行定量检测，同时存在出现假阳性或假阴性风险。因此，对于不同环节、不同样品需要结合实际情况选择适合方法或是几种方法配合使用，达到结果更准、效率更高、投入更少的目的。另外，在选择使用液相色谱或串联质谱检测方法时，建议使用内标法定量，不但可以降低基质效应的干扰，还可以避免前处理过程中目标成分丢失而造成的定量不准确。选择酶联免疫法或胶体金免疫法时，应选择质量合格且性能稳定的产品，并在使用前对产品进行验证。

硝基呋喃代谢物需要通过衍生增大分子量，改善其色谱行为，提高离子化效率，提升检测灵敏度。目前，国内检测标准和国内外报道的文献中大多数是通过加入2-硝基苯甲醛在37 ℃恒温衍生16 h，大大延长了检测时间，降低了检测效率，特别是在遭遇紧急突发事件时，延缓了检测机构结果上报。目前，部分文献报道使用新型衍生化试剂可以缩短衍生时间达到较低的检测限和较好的回收率[31，41-42]，笔者曾通过将温度提升至60 ℃，连续4 h衍生得出检测结果与连续衍生16 h差异不大，但大范围推广应用还需进一步的验证。

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