犬源芽孢杆菌分离鉴定及其耐受性的研究

2018-11-10冀婉玥林康孟林魏志波温建新

天津农业科学 2018年8期

冀婉玥　林康　孟林　魏志波　温建新

摘要：芽孢杆菌作为益生菌的一种，具备维持动物肠道菌群平衡、增强动物机体免疫力、提高动物生产性能等功能。本试验应用肉汤琼脂从正常比格犬的粪便中分离纯化出菌株，进行了染色镜检、生化试验、PCR测序及耐受性試验。结果表明：革兰氏染色阳性，镜检芽孢显著，生化试验及PCR测序的结果表明此菌株为芽孢杆菌；耐热性试验结果表明，在80 ℃条件下芽孢杆菌仍可以生长，有很高的热稳定性；耐酸试验结果表明其对酸的耐性较强，适宜的pH值应在3～5之间；在模拟胃液和肠液中，芽孢杆菌在1.5 h后的存活率均为80%左右。综合而言，分离的犬源芽孢杆菌具备耐胃液、耐高温、耐胆盐等理化特征，该试验结果为犬源微生态制剂的研制奠定了基础。

关键词：比格犬；芽孢杆菌；分离鉴定；生物学特性

中图分类号：S852.61 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.001

Abstract：Bacillus was a kind of probiotics， and has the functions of maintaining the balance of intestinal flora of animals， enhancing the immunity of animals， and improving animal production performance. In this experiment， broth agar was used to separate and purified the strains from the feces of normal beagle dogs， and staining microscopy， biochemical tests， PCR sequencing， and tolerance tests were performed. The identification results showed that Gram stain was positive， spore staining microscopic examination was clear， biochemical tests and PCR sequencing results proved that this strain was Bacillus. The heat resistance test results showed that Bacillus could grow at 80 °C and had high thermal stability. Acid resistance test results showed that it was suitable for acid resistance， and the suitable pH should be between 3 and 5. In simulated gastric fluid and intestinal fluid， the viability of Bacillus was approximately 80% after 1.5 h. The Bacillus separate from the experiment had resistance to gastric juice， high temperature， and bile salts， providing the foundation for the development of canine-derived microecological preparations.

Key words： Beagle dog； Bacillus； isolation and identification； biological characteristics

益生菌是一类与抗生素相对的有利于动物健康的活性微生物，大多汇集在人或动物的胃肠道等消化系统中，有助于维持动物胃肠道微生态的均衡[1]。益生菌制剂也称为微生态制剂，如今，我国颁布的《饲料添加剂品种目录（2006）》允许使用的益生菌包含16种。在众多的益生菌中，酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等都是符合条件的益生菌制剂和饲料添加剂，芽孢杆菌更是其中应用相对普遍的菌种之一[2]。此外，大多酵母菌也属于益生菌[3-4]。温度在37 ℃左右时，芽孢杆菌可以正常生长增殖，在 80 ℃的温度下也能够生存，具备优良的耐热、耐强酸及耐胆盐能力；对环境有很适应能力，在恶劣的环境下，芽孢杆菌能够在细胞内形成一个圆形或椭圆形的休眠体结构，即芽孢，能很好的生存下去。芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，本身没有致病因素，只有一层细胞外膜，能够分泌蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶等，可提高动物对营养物质的消化和利用能力[5]。以前的研究结果大多把芽孢杆菌作为过路菌[6]，近几年来一些最新的报告及研究结果指出有些芽孢杆菌可以黏附定殖。经试验研究显示，芽孢杆菌可以明显地减少产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的数量，其中原因是芽孢杆菌在产生芽孢的同时能够产生多种抗生素，如枯草菌素A、制霉菌素、多粘菌素、短杆菌肽等，芽孢杆菌对肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌及宋内志贺菌的拮抗作用最为显著。除此之外，芽孢杆菌还能够分泌维生素、氨基酸、促生长因子等多种营养成分，促进动物机体吸收，参与动物机体物质循环，加快动物机体新陈代谢[5]。

芽孢杆菌是国家农业部公开声明的容许可以直接饲喂动物的益生菌菌种之一，芽孢杆菌类益生菌添加剂是选取正常微生态中或自然中的无害芽孢杆菌，经过科学方法分离[7]、鉴别[8]、增殖、干燥[9]等众多工序制作的一类新型活菌制剂[10-12]。在一定的环境下，芽孢杆菌的内部结构经过一系列的变化，最终变成一个完整的芽孢，对热、酸、胃液和肠液等有较高的抗性。芽孢杆菌以芽孢的状态进入动物的肠道中，具备疾病预防，促进动物生长等功效，且没有毒性，无残留，能够萌发为具有新陈代谢功能的营养体并发挥益生作用。

本试验从健康的比格犬粪便中进行有益菌的筛选分离纯化，经生化鉴定及PCR测序从所得菌中挑选出芽孢杆菌，对其生物学特性进行了一系列的试验，以期为其应用于犬的饲料添加剂和益生菌制剂的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、革兰染色液、5%的孔雀绿染液、0.5%的沙黄染液、生理盐水、糖醇发酵管、紫外分光光度计（上海一恒科学仪器有限公司）、电子天平（上海一恒科学仪器有限公司）、高压灭菌锅（上海一恒科学仪器有限公司）、显微镜（上海一恒科学仪器有限公司）、冰箱、锥形瓶、离心管、酒精灯、水浴锅、平板、超净工作台（苏净集团安泰公司）、温箱（深圳天南海北有限公司）、恒温震荡器（深圳天南海北有限公司）、凝胶成像仪注射器（深圳天南海北有限公司）、微量移液器、枪头。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化选取肠粪便样品1 g，放入含生理盐水9 mL的离心管中，振荡混匀30 min，使其成为均匀的悬浊液，放置20 min，制成10-1的稀释液。

取200 μL样品的稀释液均匀涂布在肉汤琼脂培养基上，37 ℃恒温培养48 h。挑取单菌落在载玻片上革兰氏染色后镜检。将疑似阳性的菌落接种到肉汤琼脂培养基中纯化培养，记为“25号菌”。

1.2.2 染色镜检（1）革兰氏染色。挑取单菌落，在载玻片上进行抹片，等其自然干燥固定后，用结晶紫染液第一次染色2 min，水洗0.5 min；用碘-碘化钾溶液浸染2 min，水洗0.5 min；滴加95%酒精浸透30 s，进行脱色，水洗0.5 min；最后用红色的沙黄染液进行第二次染色，水洗，吸干，镜检。

（2）芽孢染色。挑取单菌落，在载玻片上进行抹片，待其经火焰固定后，滴加5%孔雀绿水溶液于其上，加热30～60 s，重复3～4次，水洗0.5 min；用0.5%沙黄水溶液复染0.5 min，用水冲洗，自然干燥后镜检。

1.2.3 生化鉴定根据常用试验方法对分离菌进行糖（醇、苷）类发酵试验、葡萄糖的氧化/发酵试验、甲基红（MR）试验、维培二氏试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚（靛基质）试验、尿素酶试验、柠檬酸盐利用试验、过氧化氢酶（触酶）试验、硝酸盐还原试验等生理生化试验，在37 ℃温度条件下恒温培养24 h后对结果进行观察。

1.2.4 PCR鉴定在营养肉汤培养基中将分离的菌株接种培养增殖，取1 mL菌液10 000 r·min-1离心2 min，弃去上层清液，加入20 μL生理盐水混匀，制作菌液模版。

使用芽孢杆菌属通用引物：正向引物Primer A：5'～AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG～3'，反向引物Primer B：5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'[13]。

PCR反应体系：Premixed Taq 25 μL，正反向引物各加1 μL，DNA模板2 μL，补ddH2O至体积为50 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s变性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，循环30 次；72 ℃ 5 min延伸。取5 μL PCR产物于1.0 %琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1 EB）电泳后在AlphaView S A凝胶成像仪中观察结果。

1.2.5 生长曲线及产酸试验把分离纯化出来的25号菌接种于盛有营养肉汤培养基（接种量为1∶50）的三角瓶中，在37 ℃下，选择200 r·min-1摇菌培养24 h。其中每隔2 h 取菌液在紫外分光光度计中检测菌液的OD600值和pH值，记录并制作生长曲线。

1.2.6 耐热试验查阅资料，芽孢杆菌为耐高温菌，选择80 ℃下以时间为变量进行试验。

用移液器取200 μL摇好的菌液加入到高压灭菌好的1.5 mL的离心管中，总共装3只。分别记为“25号菌80 ℃ 2 min”、“25号菌80 ℃ 5 min”、“25号菌80 ℃ 10 min”。

将分装好的3只离心管按标记分别放入80 ℃的恒温水浴锅2，5，10 min。进行倍比稀释，取稀释倍数为105，106，107三个梯度菌液各200 μL，均匀点滴在平皿中，待配好的培养基冷却至不烫手，倾注平板，每个平板10～15 mL，每个梯度做两个平行试验。培养一段时间后，进行菌落计数。

1.2.7 耐酸试验用37%的HCl溶液将液体培养基的pH值调至1.5，3.0，5.0，高压灭菌，备用。

取900 μL的pH值 1.5的培养基，加入摇好的菌液100 μL，混匀。放入37 ℃恒温水浴锅中，每30 min取出倍比稀释，取稀释倍数为103，104，105三个梯度菌液各200 μL，均匀点滴在平皿中，待配好的培养基冷却至不烫手，倾注平板，每个平板10～15 mL，每个梯度做两个平行实验。

pH=3和pH=5如上述操作依次进行。培养一段时间后，进行菌落计数。

1.2.8 耐胃液试验配置液体培养基，用37%的HCl溶液将液体培养基调至pH=3.0，高壓灭菌，备用。

按5 mg·mL-1的量在上述培养基中加入胃蛋白酶，待其彻底溶解后混匀。用0.22 mm的滤器将所得培养基过滤除菌，放入高压灭菌好的三角瓶里。按10%量接种25号菌于上述三角瓶的液体内，混匀。从三角瓶中取3.5 mL液体装到高压灭菌的4 mL离心管中，记为“25号菌0 min”，测其OD600。将剩余三角瓶中液体置于37 ℃摇床中培养，每隔30 min取出3.5 mL液体，记为“25号菌Xmin”，测其OD600。

1.2.9 耐肠液试验配置液体培养基，高压灭菌，备用。在配置好的液体培养基中按千分之三的量加入胆盐，按10 mg·mL-1的量加入胰蛋白酶，完全溶解后混匀。

用0.22 mm的滤器将培养基过滤除菌，置于高压灭菌好的小三角锥形瓶中。在超净工作台中取出3.5 mL上述液体于高压灭菌的4 mL离心管中，记为“25号菌调零液”，按10%的量接种25号菌于上述三角锥形瓶的液体中，混匀。从三角瓶中取出3.5 mL液体装到高压灭菌好的4 mL离心管中，记为“25号菌0 min”，测其OD600。将剩余三角瓶中液体置于37 ℃摇床中培养，每隔30 min取出3.5 mL液体，记为“25号菌Xmin”，测其OD600。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及染色镜检结果

把从粪便中分离纯化的菌命名为25号菌。菌落（图1-A）为干燥型，颜色为白灰色、没有光泽，表面不光滑，菌落为米粒大小；革兰氏染色（图1-B）表现阳性，镜检芽孢显著，菌体呈椭圆形；芽孢染色镜检（图1-C），在视野中观察到清晰的红色菌体，芽孢呈绿色，边缘不整齐。

2.2 生化试验结果

25号菌的生理生化试验结果见表1。依据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[9-10]的参考标准，试验结果符合芽孢杆菌的各种特性，初步判断分离菌株为芽孢杆菌。

2.3 PCR鉴定结果

25号菌用芽孢杆菌属的引物PCR鉴定，电泳结果（图2）显示，在1 600 bp处有特异性条带，跟预期相符，确定25号菌为芽孢杆菌。

2.4 生长曲线及产酸试验结果

从图3可以看出，前8 h菌株快速繁殖，25号菌此时处于对数期，OD600值处于持续增长的状态，同时pH值开始逐渐升高；8 h后，菌株OD600值和pH值处于稳定期，分别稳定在2.452和8.31。

2.5 耐热试验结果

由表2可知，在80 ℃下，随着时间的增长，菌的数量正常增长。

2.6 耐酸试验结果

从图4可以看出在pH值为1.5和3时，25号菌的数量较小，说明pH值为3和1.5不适合菌的生长；pH值为5时，25号菌生长情况良好。

2.7 耐胃液试验结果

从图5可以看出，2.5 h内，25号菌在模拟胃液中测的OD值平均在1.5左右，且随时间的增长，菌的数量有所下降；在2.5 h时，测得的OD值为1，表明25号菌仍可正常的生长。

2.8 耐肠液试验结果

从图6可以看出，25号菌在模拟肠液中的存活率随着时间的增长逐渐降低，但仍有很高的数量级；在1.5 h存活率保持在80%左右，2.5 h试验结束时存活率仍高达60%以上。

3 讨论

本次试验对从正常犬粪便中分离纯化得到的菌株进行了菌落形态观察，革兰氏染色、芽孢染色及生理生化试验，鉴定结果与从健康肉鸡粪便中分离得到的芽孢杆菌的形态特征、理化试验的结果相同[11]，经PCR鉴定确定为芽孢杆菌。菌株在前8 h处于对数期，菌株快速繁殖，8 h后处于稳定期。查阅文献[12]，芽孢杆菌为耐热菌，本次试验在80 ℃下对分离菌株进行不同时长的培养，倒板计数后利用SPSS统计软件对获得的数据进行分析，结果表现没有差异，在高温条件下，菌株能够正常生长增殖，菌株具有良好的热稳定性。耐酸试验中，在强酸环境下，菌株可以正常生长增殖，耐酸性好，适宜的pH值范围为3～5。芽孢杆菌除了维持动物胃肠道内的菌群稳定外，还有其他的有益作用尚待发掘，其作用机理仍然需要进一步研究。

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