铁皮石斛愈伤组织稳定培养体系的建立

2018-11-10许丁帆李建科刘艳军罗锐白燕娇曹凌峰丁鹏玮黄俊轩

天津农业科学 2018年8期

许丁帆　李建科　刘艳军　罗锐　白燕娇　曹凌峰　丁鹏玮　黄俊轩

摘要：为了建立稳定的铁皮石斛愈伤组织培养体系，试验开展了铁皮石斛愈伤组织最佳外植体类型、诱导培养基配方以及继代培养基配方的筛选等研究。结果表明，采用铁皮石斛茎段为外植体，愈伤组织诱导效果最好；初步诱导出的愈伤组织在MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 NAA的培养基上能够诱导生长速度快、质地硬、结构松散的理想愈伤组织；经过筛选的愈伤组织在MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培养基上进行继代培养，愈伤组织可以长时间保持理想状态。

关键词：铁皮石斛；培养基；愈伤组织；激素

中图分类号：S682.31 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.016

Abstract： In order to establish a stable callus culture system of D. candidum， the optimal explant type， callus induction medium formula， and subculture medium formula were studied and screened. The results showed that using the stems of D. candidum as explants had the best callus induction effect； the medium MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2.4-D+0.2 mg·L-1 NAA could induce the ideal callus with fast growth rate， hard texture and loose structure； the subculture medium MS+0.5 mg·L-1 KT+1 mg·L-1 2，4-D could remain the inducted ideal callus above for a long time.

Key words： Dendrobium candidum； medium； callus； hormone

我国是中草药生产的大国，近年来，由于土地资源的限制和环境变化，导致一些中草药生产受到了严重影响，随着人们对中草药有效成分的认识，越来越多的研究集中在中药有效成分的提取和生产上，这也是中药国际化的必然趋势[1-3]。利用植物愈伤组织进行次生代谢物的生产，在药用植物上越来越多。近年来，通过植物组织培养技术离体生产药用植物的有效成分逐渐受到重视[4-7]。采用愈伤组织进行生物制药的研究已经成为药用植物离体生产的主流，其主要优势有：第一，愈伤组织生长速度快，在短时间内获得大量的细胞，从而获取更多的药用成分；第二，愈伤组织容易诱导，而且易于体外控制，可以在离体条件下改变培养基成分，生产出更多的药用成分；第三，愈伤组织的培养成本较低；第四，可以利用愈伤组织进行离体诱变，选育产量高的细胞株系。目前，愈伤组织在次生代谢物生产中已经得到广泛应用，在未来生物制药领域必将发挥其重要作用。

本研究通过诱导铁皮石斛外植体产生生长稳定、组织形态理想的愈伤组织，目的是利用这类愈伤组织进行一定的科学研究或利用愈伤组织培养生产有效药物成分，为生物制药的发展奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究所用铁皮石斛组培苗由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 铁皮石斛愈伤组织诱导最佳外植体的筛选本试验采用铁皮石斛组培苗的不同组织部位作为外植体，进行愈伤组织的诱导，筛选出愈伤组织诱导效果最好的外植体类型。

剪取铁皮石斛组培苗，在超净台中将叶片、茎段和根剪下，造成两端都有伤口的外植体，其中叶片剪掉叶尖，茎段不带腋芽，根剪掉根尖。将剪好的外植体接种到提前准备的MS+2 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖培养基上诱导愈伤组织。将接种好的三角瓶放到组培室中进行培养。培养条件：温度25 ℃，24 h连续光照，光照强度1 000 lx。接种后每天观察外植体伤口部位的变化和外植体的生长情况，60 d时记录愈伤组织诱导情况。

1.2.2 不同激素对铁皮石斛愈伤组织诱导的影响根据1.2.1试验结果显示，茎段诱导的愈伤组织最好，为进一步获得结构松散、质地较硬的理想愈伤组织类型，本试验采用含有不同激素的培养基进行愈伤组织再次诱导，筛选出愈伤组织形态和生长速度最好的培养基配方。

取铁皮石斛组培苗茎段诱导出的愈伤组织，将其分割成直径2～3 mm的小块，分别接种到事先配制好的愈伤组织诱导培养基上。培养基为MS基本培养基，附加不同浓度的BA、KT、NAA和2，4-D。培养条件与1.2.1相同。

1.2.3 不同激素對铁皮石斛愈伤组织稳定生长的影响为了使1.2.2试验中获得的结构松散、质地较硬、生长快速的愈伤组织长时间保持原有状态和继代生长，本试验选用不同培养基，对愈伤组织进行继代培养，筛选出适宜铁皮石斛愈伤组织稳定生长的培养基。

选取1.2.2中诱导出的铁皮石斛理想的愈伤组织类型，在超净台中分割成大小为3～5 mm直径的小块，接种到事先配制好的含有不同浓度KT、2，4-D和NAA的培养基上，培养基配制方法和培养条件与前面相同。经过2～3次继代培养，继代过程中选择理想的愈伤组织进行继代，每次继代时间为30 d，统计每种培养基愈伤组织的生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同铁皮石斛外植体诱导愈伤组织的筛选

从表1 可以看出，采用叶片作为外植体进行愈伤组织诱导，其诱导率为0，说明铁皮石斛叶片不能诱导出愈伤组织，这可能与叶片组织中含有分生组织少有关；采用茎段和根均能诱导出愈伤组织，说明这2种外植体含有一定量的分生组织，利于愈伤组织诱导，但从愈伤组织诱导率来看，茎段高于根，说明茎段中含有更多的分生组织；从愈伤组织颜色和生长速度来看，茎段伤口诱导出的愈伤组织生长较快，颜色为传统的淡绿色，而从根诱导出的愈伤组织则生长缓慢，颜色为白色。由此可见，茎段作为铁皮石斛愈伤组织初步诱导的外植体较为适合。

2.2 不同激素对铁皮石斛愈伤组织诱导的影响

从表2可以看出，不同激素组合的培养基对于铁皮石斛愈伤组织生长的影响较大，不仅影响其生长速度，还对愈伤组织质地和结构产生较大影响。具体来看，与2 mg·L-1 2，4-D组合时，相同浓度的KT较BA更能够获得生长速度快、质地硬且结构松散的愈伤组织，说明与BA相比，KT更适合作铁皮石斛愈伤组织诱导用分裂素，但生长速度并不理想；在KT和2，4-D的基础上，加入0.2 mg·L-1生长素NAA，即可使愈伤组织生长速度加快，其中当KT为2 mg·L-1时，能同时获得生长速度快且质地和结构理想的愈伤组织。由此可见，铁皮石斛理想愈伤组织的诱导培养基为：MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 NAA。

2.3 不同激素对铁皮石斛愈伤组织稳定生长的影响

从表3可以看出，采用不同培养基获得的铁皮石斛愈伤组织的生长情况存在较大的差异，在KT+2，4-D激素组合基础上，添加生长素NAA可使愈伤组织生长速度加快，但其质地和结构均不理想，说明铁皮石斛愈伤组织稳定培养基中不宜继续添加NAA；在相同浓度的KT（1.0 mg·L-1）基础上，2 mg·L-1 2，4-D较1 mg·L-1 2，4-D条件愈伤组织的生长速度快，但其结构较松散，说明增加2，4-D的浓度会提高愈伤组织生长速度但降低其松散程度，为获得质地和结构理想的铁皮石斛愈伤组织，2，4-D的浓度以1 mg·L-1为宜，但其生长速度较慢；固定2，4-D的浓度（1 mg·L-1），0.5 mg·L-1 KT较1.0 mg·L-1 KT条件下愈伤组织生长速度快，说明降低KT的使用浓度可以缓解愈伤组织生长速度下降问题。由此可见，采用MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培养基进行继代培养可以保持铁皮石斛愈伤组织类型不变，虽然生长速度较诱导时有所下降，但可以通过缩短继代时间加以克服。

3 结论与讨论

愈伤组织从结构、质地和生长速度可以分成不同类型，其质地主要取决于组成愈伤组织的细胞在培养初期时的起源。由一个或少数几个细胞通过分裂形成的愈伤组织一般结构紧密，这种愈伤组织在生长后期只有愈伤组织团的表面几层细胞生长活跃，而内部多形成组织化，逐渐失去细胞结构，没有活细胞的功能；而由分散的多个细胞形成的愈伤组织就会结构松散，这类细胞彼此分开，这类愈伤组织从里到外均由相同细胞组成，常被用于研究和应用中[8-12]。

愈伤组织的特性由组成它的细胞类型决定，不同试验目的需要诱导不同类型的愈伤组织，用于胚性愈伤组织的诱导或进行细胞次生代谢物的生产的愈伤组织应具备结构松散、质地较硬且生长速度较快等特点，这类愈伤组织主要是由分裂能力较强、细胞质浓度较大、细胞间联系并不紧密的细胞组成[13]。因此，本试验将铁皮石斛结构松散、质地较硬且生长速度较快的愈伤组织类型作为理想的愈伤组织。

本试验通过对影响铁皮石斛愈伤组织诱导过程中的因素进行研究，获得了一套诱导松散型、质地硬且生长速度快的铁皮石斛愈伤组织类型的诱导方法：采用茎段为外植体，将其接种到MS+2 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖培养基上，进行愈伤组织的初步诱导；将诱导出的愈伤组织转接到MS+2 mg·L-1 KT+0.2 mg·L-1 NAA+2 mg·L-1 2，4-D的培养基上进行诱导，诱导出结构松散、质地硬且生长速度较快的愈伤组织类型；将这类愈伤组织接种到MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培养基上进行继代培养，愈伤组织可以长时间保持理想状态。

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