薄荷醇和茉莉精油对马铃薯抑芽效果研究

黄 涛，叶 旭，黄雪丽，李昕昀，梅 猛，余丽萍，邹 雪，王西瑶

（四川农业大学农学院，成都 611130）

马铃薯是中国第四大粮食作物，2015年我国启动马铃薯主粮化战略后，产业发展进入新的阶段。马铃薯属鲜活农产品，贮藏过程中常发生发芽、受冻、腐烂、软缩和变绿等问题，导致品质下降，经济损失严重[1]。目前，马铃薯主要通过冷藏恒温设施和化学药剂处理贮藏，能够有效降低马铃薯贮藏期的损失，但恒温贮藏库建设成本昂贵，运行费用高，还存在低温糖化的问题，影响马铃薯的加工品质。常用马铃薯化学抑芽剂，氯苯胺灵（CIPC）过量使用存在易残留，有致癌、致畸和易引起食物慢性中毒等不安全问题，并且其破坏薯芽，不能用于种薯贮藏[2]。

植物精油作为纯天然提取产物，近年来以其具有抗氧化活性及抑菌防腐特性被广泛研究应用，在果蔬保鲜方面功效显著[3-4]。薄荷醇（MEN）是薄荷精油的主要成分之一，是医药中常用的渗透促进剂，广泛应用于经皮渗透药物和日常用品如牙膏、香水中，具有抑菌和抗氧化的作用[5]；茉莉精油（JAS）成分复杂，抑菌抗氧化性强，广泛应用于食品、医疗和日用化妆领域[6]。但这两种物质在作物上的应用，特别是在贮藏保鲜和抑制马铃薯发芽方面，鲜见报道，本研究通过研究薄荷醇和茉莉精油对马铃薯块茎贮藏中萌芽的影响，探索两种物质作为天然、安全、绿色贮藏抑芽保鲜剂的潜力。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试品种：马铃薯短休眠品种“费乌瑞它”，由四川农业大学马铃薯研究开发中心提供；薄荷醇购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；茉莉精油购自吉安市国光香料厂。

1.2 试验设计

块茎贮藏及生理指标测定。挑选新鲜收获的大小均匀，表皮完整，单薯重量50～60 g的马铃薯原种块茎。摊晾于阴凉通风处，愈伤处理14 d后进行贮藏及试验处理。室温贮藏（平均气温15.9℃，平均相对湿度84%）。

薄荷醇处理：每处理取薯块2.5 kg（约40粒），放入体积为5 L的密封纸箱，薄荷醇用量为0.5、1.5、2.5 g，纸箱内自然挥发，分别记为：MEN 0.5 g、MEN 1.5g、MEN 2.5 g。茉莉精油处理：每处理取马铃薯块茎2.5 kg，放入体积为5 L的密封纸箱，茉莉精油用量2.5、5、10 mL，分别记为：JAS 2.5 mL、JAS 5 mL、JAS 10 mL。药剂装入10 mL离心管，并用胶带固定在纸箱壁上。取2.5 kg薯块不做任何处理作为空白对照（CK1）和用500 mg/kg CIPC（2.5%的粉剂）喷粉处理作为阳性对照（CK2）。每处理重复6次，其中3次用于发芽率测定、失重率测定，3次用于内部生理生化指标测定。常温贮藏60 d，每15天取样一次，每次随机取薯块6个，取顶芽芽眼部直径1 cm、深1.5 cm圆柱形用于相关指标的测定。

块茎顶芽组织形态观察。将“费乌瑞它”马铃薯原原种（新鲜收获，愈伤处理14 d）每份80粒（每粒5～8 g），装入5 L的盒里，处理为空白对照、薄荷醇2 g、茉莉精油10 mL，分别记为CK、MEN 2 g、JAS 10 mL，药剂放入盒中，自然挥发，每个处理重复3次。在贮藏的第 7、14、21、28、35、42 天，以芽眼为中心取直径为5 mm马铃薯小块，用FAA（70%乙醇∶乙酸∶甲醛=90∶5∶5）固定 24 h，置于 4 ℃保存。每次取样均在体视显微镜下解剖观察马铃薯顶芽发芽情况，拍照保存。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 发芽率测定

块茎中出现长于2 mm的芽定义为发芽，发芽率=发芽薯块数/总薯数×100%。

1.3.2 失重率测定

失重率=（g1-g2）/g1×100%，g1 为初始块茎重量，g2为测定时薯块重量。

1.3.3 淀粉含量测定

淀粉含量测定采用碘比色法[7]。

1.3.4 还原糖含量测定

还原糖含量测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[8]。

1.3.4 淀粉酶活性测定

淀粉酶活性测定采用DNS法[8]。

1.3.5 石蜡切片与显微观察

石蜡切片制作参考李兵等[9]使用方法并改进如下：

固定：将各个时期所取的样品置于FAA固定液中固定至少24 h；.

预染色、脱水：材料用70%乙醇冲洗两次，各1 h，然后用1%番红溶液（70%乙醇配制）预染色3 d，完全染色后依次置于梯度浓度乙醇中脱水；

透明：透明剂为二甲苯，先用1/2二甲苯进行过渡处理2 h，再用纯二甲苯处理2 h；

浸蜡及包埋：将材料中1/4的二甲苯倒出，再在37℃的石蜡∶乙醇=3∶2的混合液体中在处理3 d左右，在56～60℃的恒温箱中用100%的石蜡连续处理3次，时间分别为1 h；

修块、切片：蜡块用单面刀片修整，使待切部位呈长方形或方形，调整切片厚度为3～4 μm，在Leica RJAS 5ML255型切片机上进行切片；

展片、粘片、烤片：在干燥的载玻片上涂小滴粘片剂，将蜡带放入40℃蒸馏水中展平，把载玻片放入水中，使蜡带位于载玻片上，用镊子轻轻将蜡片放液面上，将此载玻片放置入30℃温箱中烘干为止，约24 h或35℃约12 h；

脱蜡、复水、染色：取已烘干的载玻片放入二甲苯（40℃）中脱蜡，8 min，转到1/2二甲苯+1/2乙醇混合液中过渡约2～3 min，依次浸入100%、95%、85%、70%、60%、50%、30%乙醇、蒸馏水各 2～3 min，再浸入0.025%甲苯胺蓝 1～2 min，蒸馏水洗 2～3 min；

封片、观察：滴一滴中性树胶在材料上盖好盖玻片，烘干，切片在ImageA2荧光显微镜下观察并照相。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2016进行处理，并用SPSS 22.0进行统计和方差分析。

另外，仪器设备需具备相关的使用记录，医疗器械临床试验经常将试验器械与对照器械同时进行对照，没有记录就没有发生，医疗单位有自己的标准操作规程，日常使用对照器械都会有仪器型号、开关机时间、运行情况等的详细记录并归档；而试验器械也应根据自身试验的特点，设计仪器使用记录表供研究者记录。对于体外诊断试剂，也应可以溯源其对应的仪器设备型号、试验运行情况是否正常、使用时间等记录。

2 结果与分析

2.1 块茎发芽动态

在常温贮藏下，薄荷醇处理马铃薯在贮藏期间的块茎形态及发芽情况见图1。贮藏60 d时，薄荷醇处理马铃薯顶芽都出现坏死黑点，未见发芽。茉莉精油处理马铃薯在贮藏期间的块茎形态及发芽情况见图2。2.5、5.0 mL处理有少许发芽，芽形态正常，10 mL处理未见发芽。

图1 薄荷醇处理马铃薯贮藏期的抑芽情况Figure 1 Bud inhibition of potato in storage period treated with menthol

图2 茉莉精油处理马铃薯贮藏期的抑芽情况Figure 2 Bud inhibition of potato in storage period treated with jasmine oil

根据块茎发芽统计结果，由图3可以看出，CK1在15 d时发芽率为55.60%，处理30 d后全部发芽。经CIPC处理的阳性对照CK2在前30 d未发芽，60 d贮藏期结束时，发芽率为6.70%。薄荷醇、茉莉精油与CK1相比均能降低马铃薯发芽率，3种薄荷醇浓度处理的薯块均未发芽，茉莉精油处理浓度越高，发芽率越低。30 d时，JAS 2.5 mL和JAS 5 mL处理的薯块有少量发芽，JAS 10 mL处理的薯块在60 d内均未萌芽。结果表明，在常温条件下，薄荷醇和茉莉精油均能显著抑制块茎萌芽。

2.2 不同处理下马铃薯芽的生长

体视显微镜观察空白对照CK的萌芽过程见图4。在贮藏21 d时即开始萌发（芽长≥2 mm），在贮藏28 d时马铃薯块茎全部萌芽。

薄荷醇处理的萌芽过程见图5。在7 d时，块茎芽眼部位即出现黑色，顶芽干枯，枯点逐渐扩大，在处理后期，顶芽周围的薯肉出现变黑现象，块茎上其他部位芽眼出现了同样的坏死。

图4 空白对照CK的萌芽过程Figure 4 The buding sage of CK

图5 薄荷醇处理后的芽坏死Figure 5 The bud necrosis treated by menthol during storage

茉莉精油处理的萌芽过程见图6。在贮藏过程中，顶芽保持较慢的生长速度，从扁平到突起经历35 d，到42 d时，发芽率为11%，芽的形态与对照未见明显差异。抑芽效果明显，能有效控制块茎顶芽的萌发，与对照相比能延后马铃薯发芽20 d左右。芽原基未受破坏，在后期贮藏中顶芽和侧芽均能正常萌发。

2.3 块茎失重率变化

图6 茉莉精油处理后的芽变化Figure 6 The change of buds treated by jasmine oil during storage

常温贮藏条件下，各处理马铃薯失重率变化见图7。马铃薯失重率随贮藏时间的延长而上升。CK1失重率显著高于CK2及不同浓度薄荷醇和茉莉精油处理。60 d贮藏期结束时，CK1的失重率为48.24%，而CK2的失重率为12.01%。薄荷醇处理失重率MEN 1.5 g＜MEN 2.5 g＜CK2＜MEN 0.5 g＜CK1，MEN 1.5 g处理失重率显著低于CK2处理。茉莉精油处理失重率，JAS 10 mL＜CK2＜JAS 5 mL＜JAS 2.5 mL＜CK1，JAS 10 mL失重率较CK2低1.38%，差异不显著。结果表明，常温贮藏下薄荷醇和茉莉精油处理

图7 不同浓度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）处理对马铃薯失重率的影响Figure 7 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on weight loss percent of potato

2.4 不同处理对马铃薯淀粉含量的影响

整个贮藏期内，马铃薯淀粉含量表现出了先降低（0～30 d）后回升（30～60 d）的变化趋势（见图 8），CK1变化幅度最大，下降最多，在贮藏30 d时，其中，CK1下降了1.24%，MEN 2.5 g处理仅降低了0.26%。30 d后各处理块茎淀粉含量逐渐回升。整个贮藏期，薄荷醇处理淀粉含量 CK1＜CK2＜MEN 0.5 g＜MEN 1.5 g＜MEN 2.5 g，各处理显著高于CK1。茉莉精油处理 CK1＜JAS 2.5 mL＜JAS 5 mL＜CK2＜JAS 10 mL，随浓度升高效果越好。贮藏60 d时，薄荷醇3个浓度处理、JAS 10 mL的淀粉含量都比CK2高，降低淀粉消耗效果较好。

图8 不同浓度薄荷醇和茉莉精油处理对马铃薯淀粉含量的影响Figure 8 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on starch content of potato

2.5 不同处理对马铃薯还原糖含量的影响

2.6 不同处理对马铃薯淀粉酶活性的影响

由图10可以得知，整个贮藏期内，块茎的淀粉酶活性表现出了先升高后降低的趋势，在45 d时达到最大值。薄荷醇处理中，薄荷醇用量越高，淀粉酶活性越低。在贮藏60 d时，薯块淀粉酶活性表现出CK1＞CK2＞MEN 0.5 g＞MEN 1.5 g＞MEN 2.5 g，说明薄荷醇能显著抑制淀粉酶的活性。经茉莉精油处理的块茎淀粉酶活性在贮藏期结束时，茉莉精油浓度越高淀粉酶活性越低，JAS 10 mL处理贮藏期结束时淀粉酶活性最低，显著低于CK1。

图9 不同浓度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）处理对马铃薯还原糖含量的影响Figure 9 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on reducing sugar content of potato

图10 不同浓度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）处理对马铃薯淀粉酶活性的影响Figure 10 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on amylase activity of potato

2.7 石蜡切片观察不同处理薄壁细胞中淀粉粒情况

不同处理的薄壁细胞中淀粉粒分布情况见图11。薄壁细胞中淀粉粒主要呈圆形或卵圆形。对照淀粉粒小，分布较少（图11a）。薄荷醇处理后的块茎薄壁细胞中淀粉粒充实饱满分布密集（图11b）。茉莉精油处理后（图11c）的马铃薯块茎薄壁细胞中也含有大量的淀粉粒，与薄荷醇处理相似。

3 讨论与结论

CIPC作为应用广泛的马铃薯抑芽剂，会杀死马铃薯块茎芽分生组织，显著降低马铃薯的重量损失和其生理代谢活动，本试验结果与前人研究一致[10-12]。本研究中，薄荷醇和茉莉精油两种新型马铃薯抑芽剂处理马铃薯块茎后，马铃薯失重率和发芽率都降低，减少了贮藏中马铃薯的损失。进一步分析发现，两种药剂处理后马铃薯块茎淀粉含量下降减速，还原糖含量变化幅度缩小，淀粉酶活性较对照低，石蜡切片也发现淀粉粒消耗较少，说明两种药剂都能抑制马铃薯生理活动水平，并且一定含量的两种物质在多项指标上均表现为抑芽效果优于CIPC。这种抑芽效果也优于其他植物精油在马铃薯上的应用[13-15]，与浓度和药剂本身效果可能都有关系。

本试验对照顶端分生组织发育以及淀粉粒变化与文义凯等[16]研究基本一致，但虽使用相同品种，本试验薯块休眠期约短10 d，可能与株系、薯块大小和贮藏环境不同有关。本实验经薄荷醇和茉莉精油处理后的马铃薯块茎萌发都受到抑制，但是体视显微观察推断两种物质抑制马铃薯发芽的作用机理不同。薄荷醇处理后7 d，即可观察到芽生长锥消失，芽眼部位变黑、干枯，芽形态畸形，在后续贮藏中整个块茎都无芽的萌发，且块茎薄壁细胞中淀粉粒含量较多。薄荷醇能够改变角质层细胞磷脂双分子层致密结构，增加其流动性，从而改变皮层透性[17]，而持续高浓度的薄荷醇涂抹处理会导致家兔破损皮肤产生鳞屑和结构变化[18]。马铃薯芽眼部位是角质层相对薄弱的位置，持续暴露在高浓度的薄荷醇环境下，可能是导致其芽死亡的原因。普红梅等[15，19]使用浓度20～80 μL/L薄荷精油处理马铃薯，发现浓度越高，抑芽效果越好，未报道芽是否死亡，可能与其使用精油浓度较低有关，其认为发挥抑芽作用的是薄荷精油的主要成分香芹酮，由此推断其使用的精油可能是绿薄荷（Mentha spicataL.）提取的精油，薄荷醇只是其少量组分之一，而非主要成分是薄荷醇的薄荷（Mentha haplocalyxL.）提取的精油。P.Teper-Bamnolker等[20]研究发现绿薄荷精油及其主要成分R-香芹酮在马铃薯抑芽上有相同的效果，30 μL/kg的绿薄荷精油和4.5 μL/L R-香芹酮都会抑制马铃薯萌芽，并且都造成芽的死亡，结合本试验推断薄荷精油中的薄荷醇和绿薄荷中的R-香芹酮在马铃薯抑芽上有相似的效果。茉莉精油处理的马铃薯块茎休眠期明显延长，随着时间的推移，部分块茎开始萌发，相比对照，芽的生长出现延缓的现象，但芽形态正常，顶芽和侧芽均可正常萌发，未见与对照明显差异，可以作为种薯贮藏控芽剂。薄荷醇和茉莉精油处理马铃薯后，虽然淀粉、还原糖含量和淀粉酶活性，以及淀粉粒数量形态出现相似的变化趋势，但从体视显微观察结果推断其更深层次的作用机制并不相同。薄荷醇抑制发芽的症状与CIPC相似，都会导致芽的死亡，推测它们作用的机制存在相似之处，但是否薄荷醇也和CIPC一样，是通过抑制薯块芽细胞纺锤体形成有待进一步试验。而茉莉精油的作用，其表现与马铃薯自身代谢抑芽物 1，4-二甲基萘（1，4-DMN）相似。M.A.Campbell等[21-22]在对马铃薯抑芽剂CIPC和1，4-二甲基萘的研究中有类似的发现，CIPC和1，4-DMN处理的马铃薯以及休眠状态的马铃薯，在转录谱上存在显著差异，CIPC和1，4-DMN作用机理不相同，都不是通过延长其自然休眠状态抑制萌芽，其进一步试验表明，1，4-DMN是通过促进细胞周期抑制子KRP1和KRP2表达来抑制马铃薯萌芽。至于薄荷醇和茉莉精油的具体分子机制，有待进一步研究。

薄荷醇和茉莉精油都是天然植物提取物，广泛应用于医疗、食品、日用化妆品，未有报道对人体危害和使用残留限定，安全性高，而CIPC因其毒性及环境危害，各国都有严格残留限定[23]。同时，CIPC抑芽效果不可逆，不能应用于种薯贮藏，在此点上，茉莉精油的可逆控芽有明显优势，可用于种薯控芽剂开发。薄荷醇原料易得，价格与CIPC相差不大，在马铃薯新型抑芽剂上有较大应用前景，适合用于商品薯贮藏药剂开发。

常温贮藏条件下，薄荷醇和茉莉精油均能有效抑制块茎发芽，降低淀粉酶活性、还原糖含量，保持马铃薯块茎中淀粉含量，减少块茎重量损失，保持了马铃薯的贮藏品质和良好的商品性。薄荷醇处理会造成马铃薯芽死亡；茉莉精油能有效抑制芽生长，不破坏芽原基，芽的后期生长正常。因此，薄荷醇适用于商品薯的贮藏药剂开发，茉莉精油既可用于商品薯的贮藏药剂开发，亦可用于种薯的贮藏药剂开发。