QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定小麦中的8种真菌毒素

2018-11-09肖全伟吴文林刘玲利

四川农业大学学报 2018年5期

肖全伟，吴文林，刘玲利

（1.成都市食品药品检验研究院，成都 610100；2.成都理工大学材料与化学化工学院，成都 610059）

真菌毒素是真菌在适宜环境下生长产生的毒性次级代谢产物，对动物和人类有遗传毒性、致癌和致畸性，同时还会引起肝肾中毒、生殖系统异常以及抑制免疫反应等，对人类身体健康造成严重威胁[1]，其中黄曲霉毒素属于极毒类，被国际癌症研究机构（IARC）划定为一类致癌物。

真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法[2-3]、气相色谱-质谱联用法[4-6]和液相色谱-质谱联用法[7-9]等。酶联免疫法检测结果易出现假阳性，适用于真菌毒素的快速检测；气相色谱-质谱联用法样品检测前常需衍生化处理，在一定程度上受到限制；液相色谱-质谱联用法拥有液相色谱高效的分离技术以及质谱高分辨率的检测能力，具有准确度高、灵敏度高、特异性和选择性强的特点，能够快速、有效同时测定多种真菌毒素，是目前开发在复杂基体样品中同时测定多种真菌毒素的良好方法。目前，国内外对小麦等原粮中真菌毒素的含量高度重视，发达国家检测标准方法中涉及真菌毒素的种类较多，且限量标准比较苛刻。我国现行的真菌毒素国家标准检测方法常只测定单一或少数几种真菌毒素，检测效率较低。为此，开发建立与国际接轨的小麦等原粮中多种真菌毒素的同时检测方法显得十分必要。

QuEChERS技术首先由M.Anastassiades等[10]于2003年在测定蔬菜和水果中的农药残留时建立，现被广泛用于动植物源性食品、土壤、化妆品、中药等基质中的兽药、农药残留或非法添加物等测定[6，9，11-16]，具有待测物回收率高、应用范围广、分析速度快、污染小和操作简单等优势。本文对QuEChERS前处理技术条件进行改进和优化，研究建立了采用HPLC-MS/MS法同时测定8种真菌毒素的高通量检测和确证方法。

1 材料和方法

1.1 试验仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪：日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）：美国ABI公司；振荡器：德国Heidolph公司；高速离心机：美国BECKMAN公司；N-EVAP水浴氮吹仪（美国OA公司）；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司。

1.2 试剂与试材

黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）：购自 Trilogy Analytical Laboratory，其中 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的浓度为 25 μg/mL，T-2、HT-2 的浓度为 100 μg/mL；二乙酸熏草镰刀菌烯醇（DAS）、赭曲霉毒素A（OTA）：购自Fermentek，纯度＞99%。乙腈和甲醇（色谱纯）：美国Honeywell公司；甲酸及甲酸铵（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷键合相硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶（PSA）、石墨化碳（GCB）和氨基键合相硅胶（NH2）均购自美国Agilent公司；硫酸镁和氯化钠（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。试验所用水均为Milli-Q超纯水。所收集的15份小麦样品均来自农户。

分别称取DAS和OTA固体标准品各1 mg，用乙腈配制浓度为100 μg/mL的单标准溶液，置于-18℃备用。

分别移取适量8种真菌毒素单标准溶液，用乙腈稀释并定容，配制成混合标准溶液，于-18℃储存。

基质匹配标准溶液：称取不含8种待测物的小麦样品，按1.3.2节方法操作，得到空白基质溶液。用空白基质溶液稀释混合标准溶液配制成一系列混合基质匹配标准溶液，且现用现配。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品制备

分别取有代表性的样品500 g，四分法缩减至少100 g，粉碎，混合均匀后装入样品密封袋中于-18℃避光保存，防止样品受污染和变质，以备用。

1.3.2 样品提取与净化

称取2.0 g（精确至0.001 g）制备样品于50 mL带螺旋盖离心管中，加入8 mL 0.3%甲酸水溶液并在高速均质器中均质30 s，振荡15 min，加入10 mL乙腈，涡旋振摇30 min后加入1.5 g硫酸镁和0.5 g氯化钠固体，剧烈振摇 2 min 后，离心 3 min（5 000 r/min）。移取离心后上层有机相2 mL至另一支10 mL具塞离心管中，加入150 mg无水硫酸镁，150 mg C18和20 mg PSA吸附剂后，旋紧螺旋盖，立即高速涡旋混合1 min，然后于4℃下离心1 min（4 000 r/min）。离心后全部上清液于水浴（45±1）℃下氮气吹干，以20%乙腈水溶液溶解浓缩物并定容至1.0 mL，涡旋混合 1 min后离心 5 min（15 000 r/min），留取上清液待测。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm i.d.）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：A-甲醇；B-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离源（ESI+）；电喷雾电压5 500 V；离子源温度550℃；监测方式：多反应监测方式（MRM）；8种待测物的去簇电压（DP）及碰撞能（CE）、定性和定量离子对等质谱参数见表2。

1.4.3 样品测定

取适量样品溶液和相应的基质匹配工作溶液系列，分别上LC-MS/MS测定，外标法定量，若样液中待测物浓度超出工作曲线范围，需稀释后再测定。

1.4.4 数据分析

回收率与精密度等数据在Microsoft Excel 2007版软件上进行分析。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The program of gradient elution

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别将浓度为0.5 μg/mL的8种真菌毒素单标准溶液直接通过针泵进样方式优化质谱条件。先在全扫描方式中优化各种真菌毒素的母离子信号，选择信号最强的准分子离子峰作为母离子。由于串联质谱的灵敏度较大程度上依赖于化合物在全扫描模式中的响应，因此需尽可能地优化全扫描质谱信号。然后通过选择离子扫描模式和子离子扫描模式优化子离子、碰撞能和碰撞气体，分别选择丰度较大的两个碎片离子为检测定性子离子，其中丰度最大的为定量子离子。优化的主要质谱参数见表2。

表2 8种真菌毒素的主要质谱参数Table 2 The MS/MS parameters of 8 mycotoxins

2.2 色谱条件的优化

图1 8种真菌毒素标准溶液的MRM色谱图Figure 1 The MRM chromatogram of eight mycotoxins

在正离子模式下，流动相呈酸性有助于提高各种待测物在质谱中的离子化效率，为获得最佳分辨率和灵敏度，比较甲酸水溶液和乙酸水溶液对待测物测定的效果。结果表明，在ESI+模式下，以添加0.1%甲酸的甲醇-水为流动相时的色谱分离和离子化效果较好，同时添加适量的甲酸铵有利于待测物的色谱分离。为此，本研究采用甲醇-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液为ESI+模式的流动相。优化的梯度洗脱程序见表1。8种真菌毒素的标准溶液MRM色谱图见图1。

2.3 QuEChERS条件优化

2.3.1 提取剂的种类及用量

QuEChERS方法中常用的提取剂有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷等。由于原粮中水分含量较低，需加水充分浸润混合均匀后再进行溶剂提取。在选择提取剂时应该考虑溶剂的极性，其既能与水互溶从而渗透到样品内部，同时通过盐析作用后又能与水分离。乙酸乙酯作为提取剂时回收率低；丙酮、甲醇是良好的提取剂，但其共萃取物较多且不易与水分离；二氯甲烷、三氯甲烷可溶解色素，而且对人体毒性强。乙腈具有上述要求的溶剂性质，对样品中的蛋白质、脂肪和糖的溶解性较小，提取效果好。因此，根据8种真菌毒素的性质和样品的基质特性，选择乙腈作为提取剂。

取一定量的阴性小麦样品，加入已知量的8种真菌毒素标准溶液，充分混匀，制成阳性样品。分别取2 g制备的阳性样品，考察不同乙腈用量对8种待测物回收率的影响。试验结果表明随乙腈用量的增加，8种真菌毒素的回收率相应提高。当提取剂体积为8 mL时，其回收率均小于70%，未达到分析要求；当提取剂体积为10 mL时，其回收率接近90%，可满足分析要求；当继续增加提取剂用量时，其回收率增加不明显。因此，考虑溶剂使用量及环保要求，确定提取剂乙腈用量为10 mL，见表3。

表3 乙腈用量试验Table 3 Selection of the amount of acetonitrile

2.3.2 样品水溶液中添加酸种类及用量

采用酸性水溶液浸润样品能使样品保持较低pH值，进而抑制待测物的离子化使其更易溶于有机相，以达到增高提取效率和保持稳定回收率的目的。常用的酸有甲酸和乙酸，其效果相近，本试验选用甲酸。

分别称取2 g制备的含8种真菌毒素的小麦样品，考察不同浓度的甲酸对其回收率的影响。试验结果表明，随甲酸浓度增加，8种真菌毒素的回收率变化不明显，均在80%以上，可满足分析要求（见表4）。为保证方法具有较强的耐受性，确定水中添加甲酸的浓度为0.3%。

表4 甲酸浓度选择Table 4 Selection of the concentration of formic acid

2.3.3 提取时间

分别考察提取时间为 5、10、20、30、60 min 时对8种真菌毒素回收率的影响。为缩短提取时间，同时提高提取效率，试验采用涡旋振摇提取方式。随提取时间增加，8种真菌毒素的回收率相应提高。当提取时间为20 min时，其回收率在82.1%～89.4%之间；在30 min时，其回收率在89.5%～99.1%之间，满足分析要求；当进一步增加提取时间时，其回收率变化均不明显，趋于稳定（见表5）。因此，选择合适的振摇提取时间为30 min。

表5 提取时间选择Table 5 Selection of extraction time

2.3.4 盐析剂的种类及用量

通过加入适量的盐析剂使水相和有机相分层，因而引起的有机相极性变化可使极性范围更宽的待测物进入有机相中，有效提高提取效率。QuEChERS方法中常用的盐析剂有氯化钠、硫酸镁、乙酸钠等。本研究采用的盐析剂为0.5 g氯化钠和1.5 g无水硫酸镁。

2.3.5 净化吸附剂种类及用量

QuEChERS技术中用于净化的吸附剂主要有：十八烷基硅烷键合相硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷键合相硅胶（PSA）、石墨化碳（GCB）、氨基键合相硅胶（NH2）等。这几种吸附剂具有各自的特点，也具有一定的共性。由表6可知，C18粉末作为吸附剂效果最好，本试验初步选定C18粉末作为吸附剂，无水硫酸镁（magnesium sulfate anhydrous，MSA）用于除去净化样液中少量的水分。但从净化液颜色看还有色素杂质，会污染质谱系统，还有可能导致较严重的基质效应。由于小麦等原粮样品基质较复杂，尽管PSA对待测物有不同程度的吸附，但它具有良好的除色素杂质及脂类性能，恰当地组合使用吸附剂可以达到最好的净化效果。因此本试验尝试加入少量PSA，与C18粉末一起组成吸附剂组合，以期达到既不损失回收率，又能达到彻底净化样液的目的。通过试验（见表7、表8），本研究选择的吸附剂种类和用量分别为150 mg C18、20 mg PSA。

表6 吸附剂选择Table 6 Selection of adsorbent（n=2）

表7 C18吸附剂用量选择（n=2）Table 7 Selection of the amount of C18（n=2）

表8 PSA吸附剂用量选择（n=2）Table 7 Selection of the amount of PSA（n=2）

此外，还对无水硫酸镁的用量进行了考察。按“1.3.2”节进行样品处理。加入150 mg C18粉末和25 mg PSA，再分别加 100、150、200、250、300、400 mg无水硫酸镁于2 mL上清液中，余下按步骤操作。分别计算其回收率，试验结果表明随无水硫酸镁加入量增加，回收率变化不大，但加入量超过250 mg，回收率有较明显偏低，可能是无水硫酸镁具有良好吸水性，用量过大导致待测物回收降低。因此本试验选择无水硫酸镁加入量为150 mg。

2.4 基质效应影响

基质效应是指被分析样品中除待测物以外的基质组分对待测物分析的干扰和测定结果准确性的影响，是由共流出物影响电喷雾接口处待测物离子化效率所致，表现为基质抑制和基质增强两种，其中基质抑制较为多见。本研究采用标准曲线法考察基质效应（ME），将绘制得到小麦样品的基质匹配标准曲线斜率与相应的标准曲线斜率进行比较。试验结果表明，基质匹配标准曲线斜率小于标准曲线斜率，即存在基质抑制效应（ME：AFB10.78、AFB20.69、AFG10.81、AFG20.75、OTA 0.92、T-2 0.83、HT-2 0.78、DAS 0.82）。本方法采用空白基质匹配标准曲线进行定量，可以减小基质效应，以达到检测分析要求。

2.5 线性关系、方法检出限和定量限

在优化条件下用HPLC-MS/MS测定配制的系列基质匹配标准溶液，以各种真菌毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，得到的线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限（以S/N≥3计）和方法定量限（以 S/N≥10计）见表 9。在 0.05～200 μg/L范围内，8种真菌毒素方法的线性关系良好，相关系数（r）均大于 0.99，方法检出限为 0.10～1.0 μg/kg，定量限为 0.25～2.8 μg/kg。

表9 8种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 9 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LQDs of eight mycotoxins

2.6 回收率与精密度

选用空白小麦样品进行3个不同浓度水平（定量限、2倍定量限、5倍定量限）的8种混合真菌毒素标准加标回收试验，在每个加标水平下分别选取6个平行样，8种真菌毒素的平均回收率为85.1%～95.4%，相对标准偏差为3.8%～8.5%，符合痕量分析要求。回收率与精密度数据见表10。

2.7 实际样品测定

采用该方法测定了收集的15份小麦样品，测定结果见表11。由表11可以看出，OTA、T-2毒素的检出率较高，分别为33.3%、46.7%，含量分别为1.55～3.45 μg/kg，2.67～70.4 μg/kg。

3 讨论与结论

将本试验检测结果与我国食品安全国家标准（GB 2761-2017）中列出的真菌毒素最大允许限量值比较（黄曲霉毒素B1≤5.0 μg/kg、赭曲霉毒素A≤5.0 μg/kg），都符合标准限量要求，表明所采集的小麦样品受黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A等污染情况较好。结合国内相关文献[17-18]，小麦普遍受到赤霉病菌等真菌侵染。考虑到小麦及其制品的消费量大，下一步课题组将拓展检测项目种类（比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、玉米赤霉醇等），增大检测样品量，较全面客观反映四川地区乃至全国内大宗粮食类的真菌毒素污染情况，以便制定切实可行的监测及防控计划。

本文建立的小麦中8种真菌毒素检测方法具有快速、灵敏、准确、可靠、环保等特点，补充了原粮中多种真菌毒素定量确证检测方法，可以为原粮质量安全的管理和控制提供技术支持。