慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血IFN-γ基因多态性分析及其临床意义探讨*

王燕，吴琦琦，庄小芳，马燕，郭峰，王晓波，王晓忠

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是一种公认的致命性肝病症候群，其特征在于肝功能急性失代偿（acute decompensation，AD），导致肝、肾、脑等器官功能衰竭，生存率低（28 d病死率为30%～40%）[1]。尽管临床引入了人工肝支持系统和抗病毒治疗，但是除非进行肝移植，ACLF患者短期预后仍然很差[2]。该病发病机制复杂，目前尚不完全明确，但多数学者认为在HBV感染导致的ACLF发病过程中免疫损伤起到了关键的作用[3]。细胞因子是体液免疫的重要介质，在HBV感染性疾病的发病过程中发挥了重要的作用。γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）是由活化的炎症细胞产生的多效能的促炎性细胞因子[4]，具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。同时，IFN-γ可诱导肝细胞凋亡或抑制肝细胞周期进程[5]。IFN-γ基因位于染色体12q24上，跨度约为5.4 kb，由四个外显子、三个内含子组成[6]，与免疫应答机制的启动和调节关系密切。 IFN-γ基因多态性可通过影响IFN-γ的转录、翻译和表达过程，导致不同个体IFN-γ的产量及宿主免疫功能的差异，从而影响HBV携带者的不同临床转归。IFN-γ的第一个内含子中+874 T/A（rs567588525）位点 TT基因型产生高水平IFN-γ，有助于宿主对病毒感染的防御。相反，基因型TA和AA导致IFN-γ产生水平低，可能增加了病毒感染的风险。此外，含有+874T/A和 +2109A/G（rs34066384）的 DNA序列是 NF-κB转录因子的特异性结合位点，直接影响IFN-γ表达量。如果该通路受到影响，可能会导致氧化损伤[7]。我们分析了HBV感染导致的ACLF患者IFN-γ基因多态性与发病和临床结局的关系，以探讨IFN-γ基因+874位点和+2109位点基因多态性在本病发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2016年1月～2017年2月在新疆医科大学附属中医医院住院的由HBV感染导致的ACLF患者51例，男性37例，女性14例；年龄23～75（49±2）岁。严格按照《肝衰竭诊治指南（2012年版）》的标准诊断[8]：即①极度乏力，有明显的消化道症状；②黄疸迅速加深，血清总胆红素（TBIL）大于正常值上限10倍或每日上升≥17.1 μmol/L；③出血倾向明显，PTA≤40%（或INR≥1.5），并排除其他原因导致的凝血功能障碍者。排除合并原发性肝癌、妊娠、肝移植者、有严重心肺肾功能不全及其他恶性肿瘤患者。另选在我院体检的健康人50例，男性30例，女性20例；平均年龄48±2（24～72）岁，既往无肝炎病史，血清肝炎病毒标志物均阴性，HBV DNA阴性，肝功能正常。

1.2 单核苷酸多态性（SNP）分型检测 本实验采用SNaPshot SNP分型技术对101个样本进行2个SNP位点分型。 设计了两对PCR引物用于扩增包含2个位点的2个150～350 bp片段，设计了2个紧邻的SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸（+874位点引物，上游引物（F）：5’-TCTGGCTTAGG TATCATAA-3’，下游引物（R）：5’-GG CTTCATAAAATGAGGG-3’。+2109 位点引物，F：5’-GCAAATG ATTTCTCTCAGC-3’，R：5’-GGAATGAGACAGGTGAGAT-3’）。引物用在线（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）Primer3软件设计。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱酶（SAP，from Promega）和外切酶 I（EXO I，from Epicentre）纯化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用SAP（from Promega）纯化后，在ABI3730xl上样。SNP分型用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）进行分析（以上实验过程由SNP试验公司完成）。

1.3 统计方法 应用 SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验或方差分析；计数资料采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACLF患者入院时肝功能指标变化 入院时，ACLF患者 ALT为 506.07±709.63 U/L，AST为504.66±623.21 U/L，AKP 为 196.13±219.62 U/L，GGT为121.45±121.07 U/L，TBIL为267.07±144.06 μmol/L，ChE 为 3136.32±2682.00 U/L，ALB 为29.59±5.59 g/L，TG 为 1.81±1.50 mmol/L，TC 为1.39±1.52 mmol/L，GLU 为 5.90±2.15 mmol/L，BUN为 8.06±8.31 mmol/L，Cr为 103.35±99.80 μmol/L，PLT为（113.62±64.42）×109/L，PT 为 23.96±7.41 s，PTA为32.04±10.86%，FIB为1.67±0.80 g/L。

2.2 两组血IFN-γ基因两个位点多态性Hardy-Weinberg平衡检验结果比较 经Hardy-weinberg遗传平衡定律检验，ACLF患者+874位点和+2109位点的实际数与理论数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明各基因频率已达到遗传平衡，具有群体代表性（表1）。

2.3 两组IFN-γ基因+874位点T/A等位基因及基因型分布频率比较 ACLF患者+874位点TA+AA基因型频率显著高于健康人（P＜0.05），提示TA+AA基因型患ACLF的风险是TT基因型的2.363倍（OR=2.363，95%CI：1.057～5.281）；+874 位点 A 等位基因频率显著高于健康人（P＜0.05），提示A等位基因患ACLF的风险是T等位基因的2.195倍（OR=2.195，95%CI：1.182～4.076，表 2）。

2.4 两组IFN-γ基因+2109位点A/G等位基因及基因型分布频率比较 ACLF组+2109位点AG+GG型基因型频率显著高于健康人（P＜0.05），提示AG+GG基因型患ACLF的风险是AA基因型的2.96倍；G等位基因型显著高于健康人，提示G等位基因患ACLF的风险是A等位基因的2.51倍（表3）。

表1 两组血IFN-γ基因两个位点多态性Hardy-Weinberg平衡检验结果（%）比较

表2 两组血IFN-γ基因+874位点T/A等位基因和基因型分布频率（%）比较

表3 IFN-γ基因+2109位点A/G等位基因及基因型分布频率（%）比较

2.5 不同IFN-γ基因型ACLF患者Child-Pugh评分和MELD评分比较 依据患者入院后的首次实验室检测结果，计算患者Child-Pugh评分和MELD评分。结果显示，IFN-γ基因+874位点与+2109位点各基因型间Child-Pugh评分和MELD评分均无统计学差异（P＞0.05，表 4、表 5）。

2.6 不同临床结局ACLF患者血IFN-γ基因+874位点和+2109位点等位基因和基因型分布频率比较 在治疗3个月末，ACLF患者生存28例，死亡23例（45.1%）。两组IFN-γ基因+874位点、+2109位点基因型及等位基因分布频率均无显著性差异（P＞0.05，表 6、表 7）。

表4 不同IFN-γ基因+874位点基因型ACLF患者两项评分（±s）比较

表4 不同IFN-γ基因+874位点基因型ACLF患者两项评分（±s）比较

IFN-γ基因+874位点基因型（n=51）TT（n=23） TA（n=17） AA（n=11）Child 评分 11.04±1.692 10.88±1.536 11.45±1.293 MELD 评分 26.00±4.796 24.53±4.810 27.36±6.153 F 0.457 1.057 P 0.636 0.355

表5 不同IFN-γ基因+2109位点基因型ACLF患者两项评分（±s）比较

表5 不同IFN-γ基因+2109位点基因型ACLF患者两项评分（±s）比较

IFN-γ基因+2109位点基因型（n=51）AA（n=25） AG（n=19） GG（n=7）Child 评分 10.80±1.291 11.21±1.843 11.71±1.496 MELD评分 25.44±5.723 26.42±4.426 25.43±5.159 F 1.044 0.088 P 0.360 0.916

表6 两组ACLF患者IFN-γ基因+874位点T/A等位基因及基因型分布频率（%）比较

表7 两组ACLF患者IFN-γ基因+2109位点A/G等位基因及基因型分布频率（%）比较

3 讨论

HBV感染已被确定为亚太地区ACLF的主要病因[9]。ACLF是慢性乙型肝炎（CHB）患者短期病死率升高的主要因素。HBV感染后的表现是由病毒和宿主的相互作用决定的，细胞介导的免疫反应参与病毒的清除以及在此期间的疾病发病过程，细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-10，肿瘤坏死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α），IFN-γ 等与 ACLF 患者疾病临床预后和肝细胞坏死密切相关[10]。其中辅助性T淋巴细胞分泌的IFN-γ在诱导病毒清除方面发挥重要的作用[11]。IFN-γ作为抗原提呈细胞和淋巴细胞增殖、分化的调节剂，参与细胞炎症反应和抗病毒免疫，高表达量的IFN-γ对病毒的清除有重要作用。在宿主早期特异性防御阶段，IFN-γ释放增加T细胞的细胞毒性和自然杀伤细胞活性，增强细胞免疫应答。在随后的抗原特异性免疫应答阶段，IFN-γ可作为抗原呈递、增殖以及淋巴细胞分化的调节剂[12]。IFN-γ各位点基因多态性可以影响IFN-γ表达，并以此方式影响免疫应答过程[13]。

本研究对新疆地区51例ACLF患者和50例健康人血IFN-γ基因+874位点和+2109位点多态性进行了分析。结果显示ACLF组TA+AA基因型频率（54.9%）显著高于健康人（24.0%），提示TA+AA基因型患ACLF的风险比TT基因型高2.365倍。同时，T/A等位基因分布频率在ACLF（T：61.8%，A：38.2%）和健康人（T：78.0%，A：22.0%）间有明显的差异，A等位基因患ACLF的风险是T等位基因的2.195倍，表明A等位基因和基因型是ACLF的遗传易感基因。健康人T等位基因和基因型频率显著高于ACLF组，由于T等位基因与IFN-γ的产量增加相关，从而使宿主免受疾病的侵扰[14，15]。

+2109位点位于IFN-γ基因的第3内含子区，此区的多态性能够调节核因子与IFN-γ基因的结合，从而可能会影响IFN-γ mRNA表达水平[15]。在AA、AG、GG 基因型中，GG基因型是慢性活动性肝病的易感基因型。本研究结果显示，AA、AG+GG基因型频率在ACLF患者（49.0%，51.0%）和健康人（74.0%，26.0%）之间有明显的差异，提示AG+GG基因型人群患HBV-ACL F的风险是AA基因型的2.96倍。ACLF组G等位基因频率（32.4%）显著高于健康人（16.0%），提示携带G等位基因的人群患ACLF的风险是A等位基因的2.511倍，IFN-γ+2109位点G基因型和等位基因可能影响机体免疫抗病毒过程。但尚不清楚+2109位点基因多态性的A至G转换是如何影响IFN-γ基因转录的[16]。

研究表明，IFN-γ可以促进细胞吞噬、促使病原体被杀灭、干扰病毒生长，是肝脏免疫病理损伤的重要效应分子。在ACLF患者，血清IFN-γ水平高于慢性乙型肝炎患者和正常人群[17]。由于I型干扰素（IFNs）主要由树突状细胞（DC）产生，DCs的数量和功能与ACLF患者的预后密切相关。所以，在ACLF发病初期IFN-γ呈高水平表达，经过治疗后IFN-γ水平降低，IFN-γ水平与病情进展和预后呈正相关关系[18]。本研究比较了ACLF患者三个月的临床结局，结果显示，IFN-γ基因多态性与患者临床结局差异无统计学意义。由于肝衰竭发生和发展是由多因素参与的一个复杂过程，病情发展过程变化迅速。既往研究提示肝衰竭进展至中晚期时，常常合并多种并发症，且并发症间可相互影响，从而加重肝衰竭患者病情进展，进一步增加了死亡的风险。本研究仅用入院后第一次的实验室数据进行肝衰竭预后评分，分析预后评分与IFN-γ基因多态性的关系，尚缺乏对疾病预后的动态性预测，因此其可靠性受到了影响。

由于 IFN-γ基因还存在其他位点的SNP，且这些多态性与 IFN-γ表达和分泌的关系还不明确。同时，ACLF的临床表现复杂多变，受基因、机体免疫和环境因素共同作用的影响。IFN-γ基因多态性与 HBV ACLF发病的关系及该位点不同基因型与其他细胞因子的相互作用，还需要更深入的研究。