血清IL-17水平及其基因多态性与HBV感染临床转归之间的关系研究*

何 胜，张 震

白细胞介素（IL）-17是促炎细胞因子，与多种炎性疾病的发生有关[1-4]。有报道称IL-17可以激活其他细胞因子，引起炎症反应的级联效应，从而致病[5-7]。但是也有研究发现，IL-17具有抗病毒作用[8]。本研究探讨了血清IL-17水平及其基因 IL-17-197A/G位点单核苷酸多态性与HBV感染临床转归的关系，旨在为HBV感染的防治提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015年3月～2017年8月在我院就诊的自限性HBV感染者80例，无症状慢性HBV携带者60例，慢性乙型肝炎患者120例，乙型肝炎肝硬化患者40例。符合慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准[9]，其中无症状慢性HBV携带者为血清HBsAg阳性，1年内随访3次以上，每次间隔至少3个月，血清ALT水平均正常；自限性HBV感染者为无急慢性乙型肝炎病史，未接种过乙肝疫苗，血清抗-HBs和 /或抗 -HBc或抗 -HBe阳性，HBsAg和HBeAg阴性，肝功能正常。排除标准：1）合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等其他嗜肝病毒感染；2）酒精性肝病、代谢性肝病、自身免疫性肝病等。本研究已经本院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 检测方法 采用ELISA法检测血清IL-17水平[10]（武汉博士德生物有限公司，使用美国伯腾仪器有限公司生产的SynergyH4酶标仪，在490 nm波长下读取OD值，并计算IL-17水平）；使用全自动生化分析仪（AU5800，美国贝克曼库尔特公司）检测血生化指标；采用PCR法检测血清HBV DNA水平（广州达安公司，使用美国赛默飞有限公司提供的DA7600型PCR分析仪）。

1.3 血清IL-17等位基因和基因频率检测 使用DNA提取试剂盒（中国东盛生物有限公司）提取总DNA，采用PCR法检测IL-17-197G/A位点的单核苷酸多态性。引物由北京安必奇生物科技有限公司设计并合成，上游引物为5’-AACAAGTAAGAATG AAAAGAGGACATGGT-3’，下游引物为 5’-CCCCC AATGAGGTCATAGAAGAATC-3’。扩增条件为：90℃变性 10 min，60℃退火 1 min，循环 35次，72℃延伸10 min。使用单核苷酸检测试剂盒（北京伯乐生命科学发展有限公司）检测，全自动检测分析三个位点（AA、AG、GG）的基因多态性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件行统计学分析，本研究资料均符合正态分布，计量资料以（±s）表示，血清IL-17水平的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD方法，组间单核苷酸位点等位基因和基因多态性的分布频率比较采用x2检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IL-17水平比较 乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平显著高于慢性乙型肝炎组、无症状慢性HBV携带者组和自限性HBV感染者组（F3，296=102.8，P 均＜0.05）；慢性乙型肝炎组血清IL-17水平显著高于无症状慢性HBV携带者组和自限性HBV感染者组（P均＜0.05，图1）。

2.2 慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化血清IL-17水平分层比较 在乙型肝炎肝硬化组，血清高HBV DNA载量组（＞1×105copies/mL）血清IL-7水平更高（t=5.1，P＜0.05），血清 ALT＞40 U/L 组血清 IL-7水平更高（t=10.7，P＜0.05）；在慢性乙型肝炎组和乙型肝炎肝硬化组，血清AST＞40 U/L组血清IL-7水平更高 （t=24.5，P＜0.05；t=22.4，P＜0.05），血清TBIL＞20 μmol/L组血清 IL-7水平更高（t=7.3，P＜0.05；t=12.8，P＜0.05，表 1）。

图1 各组血清IL-17水平比较

2.3 各组血清IL-17-197A/G位点基因型和等位基因分布频率比较 乙型肝炎肝硬化组IL-17-197 AA基因型和A等位基因分布频率最高，慢性乙型肝炎组GG基因型和G等位基因分布频率最高，HBV携带者组AA基因型和A等位基因分布最高，自限性HBV感染GG基因型和G等位基因分布最高（表2）。

3 讨论

本研究发现乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平最高，无症状慢性HBV携带者和自限性HBV感染者血清IL-17水平较低。乙型肝炎肝硬化IL-17-197 AA基因型分布频率高，占75.0%；自限性HBV感染AA基因型的分布频率低，占10.0%，GG基因型分布频率高，占75%。乙型肝炎肝硬化A等位基因的分布频率高，占57.5%；自限性HBV感染A等位基因的分布频率低，占20.0%，G等位基因分布频率高，占80.0%，说明AA基因型和A等位基因增加了HBV感染的不良转归。

表1 不同指标水平慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平（ng/m l,±s）的比较

表1 不同指标水平慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者血清IL-17水平（ng/m l,±s）的比较

①P＜0.05

例数 慢性乙型肝炎（n=120） 例数 乙型肝炎肝硬化（n=40）HBV DNA（copies/mL） ≤1×105 32 4.2±0.4 26 6.0±0.3＞1×105 88 4.1±0.3 14 6.8±0.5①ALT（U/L） ≤40 51 3.7±0.4 22 4.8±0.5＞40 69 3.6±0.3 18 6.9±0.7①AST（U/L） ≤40 35 4.0±0.1 25 6.2±0.5＞40 85 4.9±0.3① 15 8.9±0.4①TBIL（μmol/L） ≤20 40 3.5±0.5 26 4.5±0.5＞20 80 4.1±0.2① 14 6.9±0.6①

表2 各组IL-17-197A/G 位点基因型和等位基因分布频率（%）的比较

IL-17是在小鼠细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杂交瘤中分离出来的CTLA-8的cDNA序列，是一种新型细胞因子家族，参与了机体炎症和免疫防御过程，与自身免疫性疾病密切相关[11，12]。既往研究发现，在胞外菌感染过程中，多种不同病原体可诱导细胞分泌IL-17，IL-17进一步又可刺激IL-6、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等促炎细胞因子的产生，导致炎症反应的产生[13-15]。有报道称，慢性乙型肝炎患者外周血IL-17水平均升高，而抗炎细胞因子IL-10水平下降[16]。结果表明，IL-17在HBV感染和病毒慢性化进程中起到重要作用，结果与有关研究一致[17，18]。既往研究发现，病毒性肝炎进展为肝硬化与感染的抗原量无关，但是与病毒毒力和肝功能损伤程度有关[19]。我们根据HBV DNA载量的高低将慢性乙型肝炎组和乙型肝炎肝硬化组进一步分为HBV DNA载量≤1×105copies/mL和＞1×105copies/mL两个亚组，并根据肝功能指标的高低进行分组，发现乙型肝炎肝硬化组高病毒载量组人群血清IL-7水平更高，血清ALT＞40 U/L组血清IL-7水平也更高；在慢性乙型肝炎组和乙型肝炎肝硬化组，血清ALT＞40 U/L组血清IL-7水平升高，TBIL＞20 μmol/L组血清IL-7水平升高。

对IL-17基因多态性分析显示，肝硬化患者IL-17-197 AA、AG和GG基因型分别为75.0%、10.0%和15.0%，等位基因A分布频率为57.5%，G分布频率为42.5%，而慢性乙型肝炎患者则分别为25.8%、16.7%、57.5%和34.2%、65.8%，组间差异显著（P＜0.05），乙型肝炎肝硬化组以 IL-17-197 AA基因型和A等位基因分布频率为主，慢性乙型肝炎组以GG基因型和G等位基因分布频率为主，HBV携带者组以AA基因型和A等位基因分布为主，自限性HBV感染者以GG基因型和G等位基因分布为主。慢性HBV感染后对病毒的清除能力在不同人群因遗传背景不同而有高低之分。AA基因型分布频率与血清IL-17水平趋势相似，IL-17A/G AA基因型和A等位基因可能增加了HBV感染的不良转归。研究[20]发现IL-17基因多态性与慢性HBV感染有关，并且AA基因会增加慢性乙型肝炎进展为肝硬化的发生风险。

本研究的局限性有以下几个方面：1）本研究为单中心研究，未考虑不同人种和区域的差异；2）样本量较小，结果可能会有所偏倚。