丹参川穹嗪对尿酸肾损伤模型大鼠FOXO3α表达影响

陈洪英 ，王海

（1.成都心血管病医院肾内科，四川 成都 610000；2.成都中医药大学药学院，四川 成都 610000）

0 引言

原发性高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱以及尿酸过量产生或排泄减少所引起的一种多基因疾病，这种疾病由于高发病率且能导致多器官损伤，其复杂的机制和治疗局限性是国际医学界面临的一个难题[1]。肾脏是尿酸代谢的主要器官，通过肾脏排泄的大量尿酸晶体直接介导并参与肾损伤的发展。此外，高尿酸血症可以过度激活肾素-血管紧张素系统和内皮素并导致高血压，损伤肾小动脉内皮细胞功能并刺激血管平滑肌细胞增殖。这些过程可导致肾小球输入动脉壁硬化和增厚进而引起继发性肾小管间质炎症和纤维化[2]。丹参川穹嗪含有四甲基吡嗪、丹参酮和丹参酸等，能够改善患者血管微循环并降低患者体内炎性因子含量，对治疗糖尿病肾病有一定作用效果[3]。尿酸肾病的发病机制较多但是相关研究很少，本研究通过建立高尿酸血症诱导的大鼠肾损伤模型，探讨丹参川穹嗪干预高尿酸诱导肾损伤的分子机制并为治疗尿酸性肾病提供新的思路。

1 材料

1.1 动物

健康雄性Sprague Dawley大鼠，体重为190-210g，购于江苏南农高科技股份有限公司[证书号SYXK(苏)2016-0056]。SPF鼠饲料由江苏省协同医药生物工程有限公司提供[货号：xt007]。

1.2 药物，试剂和仪器

丹参川穹嗪购于贵州拜特制药有限公司，每支5mL，4℃冰箱保存备用。别嘌呤醇胶囊0.25 g/片(共10片)(批号15010901)购于黑龙江省奥力达奈德制药有限公司。腺嘌呤(批号A8626)和羧甲基纤维素钠(批号21902)购于Sigma-Aldrich公司。大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批次No.M1752164)购于深圳欣博盛生物科技有限公司。抗TLR4抗体(批号ab13556)，抗FOXO3α抗体(批号ab12162)和抗NLRP3抗体(批号ab214185)购自于Abcam公司。HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(货号CW2569)购于杭州诺扬生物技术有限公司。KAPA SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix (2x)(批号KK4601) 购于上海高创化学科技有限公司。所使用的仪器是HC-3018R高速冷冻离心机；5810R台式冷冻离心机；JY300C电泳仪和电泳槽，JY-2Y1转膜仪；ChampGel5000凝胶成像仪；StepOne Plus实时定量PCR仪；MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪。

2 方法

2.1 建模，分组和干预

大鼠自由获取水和食物并适应环境1周后，将大鼠随机分为正常对照组(n=6)和造模组(n=30)。正常对照组蒸馏水灌胃10mL/kg每天并喂食正常饮食。将腺嘌呤溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中并通过灌胃给予造模组100mg/kg每天，连续18天。从大鼠眼眶采血，当血尿酸水平高于82.50μmol/L且与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05)时认为大鼠高尿酸血症模型造模成功。收集笼中模型大鼠的24小时尿液，当发现尿蛋白浓度显著高于正常组时，表明肾损伤且是尿酸造成的肾损伤。将30只模型大鼠通过随机数表分为模型组，别嘌呤醇（5mg/kg灌胃）阳性药物组和低、中、高剂量(10、20、40mg/kg灌胃)丹参川穹嗪组，每组6只，干预持续6周。

2.2 标本收集

6周灌胃后，随机选取各组大鼠一半，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后通过腹主动脉取血。离心收集血清，收集上清液于-80℃保存，用于ELISA和生化指标检测。收集血液后处死大鼠并取出肾脏。将肾冷冻并储存在液氮中用于随后的RT-PCR和Western blot分析。

2.3 指标检测

采用RT-PCR检测肾组织中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因转录水平，TriZol提取100mg肾组织RNA以进行逆转录获得cDNA。PCR反应液 为10μL包 含SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)5μL加 上 游 引 物 (10μmol/L)0.2μL加 下游 引物 (10μmol/L)0.2μL加 cDNA 1μL加不 含 核酸酶的超纯水(3.6μL)。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，退火5s，60℃延伸34s，共40个循环。进行溶解曲线分析以鉴定PCR产物的特异性。引物设计和合成见表1。Western blotting检测肾组织中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白的表达，将100mg肾组织添加到1mL蛋白质提取试剂中混匀。离心后收集上清液，用二辛可宁酸测定试剂盒测定蛋白质浓度。将样品蛋白质浓度调整至相同水平，加入样品缓冲液，并在95℃变性5min之后储存以备后用。使用8%，10%和12%分离凝胶和5%间隔凝胶进行SDS聚丙烯凝胶电泳。当溴酚蓝跑到凝胶的末端时电泳终止。湿膜转移90min。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭。稀释一抗并放入PVDF膜在4℃下孵育过夜。将二抗体以1：10000的比例稀释并与PVDF膜孵育40min。化学发光显影后扫描蛋白质条带并分析。ELISA用于检测血清MCP-1蛋白水平，根据制造商说明进行ELISA。

表1 引物设计

2.4 统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件进行分析，GraphPad Prism7软件绘图。数据表示为平均值±标准差()。单因素方差分析用于多组比较。两组之间使用最小显著性差异检验（LSD）进行比较。P值＜0.05认为具有统计学差异。

3 结果

3.1 肾组织中FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1 mRNA转录水平

在第6周时与正常组相比，模型组FOXO3α的mRNA转录水平显著下调，TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA水平显著上调(P＜0.05)。与模型组相比，丹参川穹嗪3组的FOXO3α的mRNA转录水平显著上调，3组丹参川穹嗪组的TLR4、NLRP3和MCP-1的mRNA转录水平明显下调(P＜0.05,图1)。

3.2 肾组织中FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白水平

第6周与正常组相比，模型组FOXO3α的蛋白表达水平显著下调，TLR4和NLRP3蛋白表达水平显著上调。第6周与模型组相比，丹参川穹嗪3组的FOXO3α蛋白质表达水平显著上调，TLR4和NLRP3蛋白质表达水平显著下调(P＜0.05，图2)。

图1 丹参川穹嗪对尿酸性肾病大鼠FOXO3α，TLR4，NLRP3和MCP-1基因表达的影响

图2 丹参川穹嗪对尿酸性肾病大鼠FOXO3α，TLR4和NLRP3蛋白表达的影响

图3 丹参川穹嗪对尿酸性肾病大鼠血清MCP-1蛋白表达的影响

3.3 血清中MCP-1蛋白表达水平

在第6周与正常组相比，模型组在6周时血清MCP-1蛋白表达水平显著上调(P＜0.05)。与模型组相比，3组丹参川穹嗪组血清MCP-1蛋白表达水平在第6周显著下调 (P＜0.05，图3)。

4 讨论

丹参川穹嗪可改善改善血管内皮功能和肾脏的微循环灌注状态，清除炎性细胞因子同时实现肾功能保护[4]。TLR是一种I型跨膜蛋白，是先天性免疫系统的主要模式识别受体。在高尿酸血症分子水平研究中发现Toll样受体（TLR）介导的免疫信号通路和冷炎素（cryopyrin）炎症信号通路能够被尿酸盐激活[5]。TLR在哺乳动物中能将细胞外抗原识别信息传递到细胞中并导致炎症反应[6]。TLR和相应配体结合导致一系列蛋白级联反应，包括激活NF-κB和JUN/FOS从而诱导许多快速反应基因的激活并产生参与炎症反应的效应分子。TLR4在介导炎症反应信号转导中起主导作用，TLR4通过著名的TLR4/NF-κB炎症通路诱导并激活NF-κB参与肾损伤微炎症状态的发展并介导肾间质纤维化的发生和发展[7]。研究表明，在白细胞活化后，尿酸盐通过先天性免疫系统中的TLR2和TLR4激活炎性因子，然后激活白细胞介素[1]，导致炎症效应和组织损伤[8]。我们的研究结果表明，丹参川穹嗪有效地下调了TLR4的转录和蛋白质表达，丹参川穹嗪可能通过抑制TLR信号通路减轻尿酸性肾病大鼠肾脏炎症反应，从而减轻肾脏损伤。

冷炎素(cryopyrin)也被称为NALP3，是编码细胞内NOD样受体(NLRs)家族成员，参与炎症复合体的形成，主要在中性粒细胞，单核巨噬细胞和一些原代免疫细胞中表达[9]。在我们的研究中模型组NLRP3的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组，提示过表达的NLRP3在高尿酸血症性肾病大鼠中介导免疫炎性肾组织损伤。肾小管上皮细胞的MCP-1表达水平与肾小球损伤程度相关，肾间质局部产生的MCP-1也参与肾小管间质损伤。MCP-1通过作用于肾小管上皮细胞激活NF-κB并增加IL-6和细胞间粘附分子1的表达[10]。肾脏中的尿酸盐沉积直接刺激肾组织中MCP-1蛋白表达的增加，并通过激活NF-κB诱导炎性因子激活，引起肾血管炎症反应和巨噬细胞浸润并促进肾间质纤维化[11]。在我们的研究中尿酸性肾病模型大鼠血清中MCP-1蛋白显著高表达，丹参川穹嗪和别嘌呤醇能逆转模型组大鼠肾脏中NLRP3和血清中MCP-1蛋白的表达，改善肾脏炎症病变，我们推测NLRP3和MCP-1可能作为治疗高尿酸血症性肾病新的药物治疗靶点。

FOXO3α是叉头框蛋白家族转录因子的成员，最近的研究表明它在抑制炎症反应中发挥重要作用[12]。FOXO3α也可能通过调节单核巨噬细胞的数量和功能或抑制单核巨噬细胞的过度活化而参与炎症反应的调节[13]。研究已经报道FOXO3α基因缺失小鼠的脾内发生了炎性细胞浸润，FOXO3α基因缺陷小鼠与野生型小鼠相比NF-κB活化明显增强并引起T细胞自发性增殖及慢性炎症细胞浸润[14]。FOXO3α也是P13K/Akt信号通路的下游分子，炎症信号通过磷酸化激活PI3K/Akt从而诱导Akt与核内FOXO3α结合并致其磷酸化，磷酸化的FOXO3α从DNA的结合位点分离出来，并从细胞核进入细胞质，从而降低其转录活性并阻断TLR4信号转导通路[15]。在病原体激活的抗原呈递细胞中FOXO3α可抑制TNF-α和IL-6等炎性细胞因子产生[16]。因此，FOXO3α对调节免疫介导的炎症具有 重要的生物学作用。

我们的研究结果表明，丹参川穹嗪显著上调大鼠肾组织中FOXO3α的mRNA和蛋白表达，可以抑制免疫炎症关键信号分子TLR4，NLRP3和MCP-1的生物学活性。我们推测丹参川穹嗪能够改善高尿酸血症介导的肾脏免疫炎症损伤。