肝X受体α与蛋白酶体激活因子28γ在胃癌中的表达及其对胃癌细胞生长的影响

陈冠阳，陈子华，袁伟杰，高昱，杨伟民，陈志康

（中南大学湘雅医院 1.胃肠外科 2.结直肠肛门外科，湖南 长沙 410008）

胃癌是世界第五常见恶性肿瘤，我国是胃癌高发地区[1-2]。传统的胃癌治疗是以手术为主，结合化疗等其他方法的综合治疗。目前，胃癌的分子靶向治疗日新月异，越来越多的基因受到人们的关注，成为胃癌治疗的潜在靶点[3]。

肝X受体（liver x receptor，LXR）属于核受体家族的一员，包括LXRα（也称为NR1H3）和LXRβ（也称为NR1H2）两种亚型，在糖类、胆固醇、脂肪酸的代谢过程中起到了重要的调节作用[4]。近年来的研究发现LXR参与肿瘤的免疫调节[5]，并在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用[6]。GW3965是LXR的激动剂，能特异性激动上调LXR[7]。在前期的工作中，笔者通过高通量测序发现：上调LXRα后，胃癌细胞AGS中蛋白酶体激活因子28γ（PA28γ）的mRNA表达水平出现了明显下调。 蛋白酶体激活剂PA28γ是11S蛋白酶体激活剂家族（REG家族）成员之一，能够通过一种不依赖泛素化和ATP的方式降解目的蛋白，从而参与调控细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期及免疫应答等[8]。PA28γ在多种恶性肿瘤中高表达，发挥促癌作用，与多种肿瘤的预后、发生和临床病理特征密切相关[9]。因此推测：在胃癌细胞AGS中，LXRα可能与PA28γ存在一定联系；这可能是LXRα发挥抑癌作用的机制之一。

本研究首先使用免疫组织化学染色和qRTPCR确定了LXRα、PA28γ在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况；分析LXRα和PA28γ蛋白表达的相关性；并分析了LXRα、PA28γ蛋白的表达水平与临床病理参数的关系。接下来选择胃癌细胞株AGS为研究对象，利用LXRα过表达慢病毒载体处理AGS细胞；通过流式细胞术探究了LXRα对AGS细胞细胞周期的影响；并通过qRT-PCR和Western blot验证了LXRα对PA28γ表达水平的影响。最后在动物实验中进一步验证LXRα对AGS细胞增殖的影响。旨在为理解LXRα、PA28γ在胃癌增殖中的地位、作用和可能机制提供了新的实验依据和思路，并为LXRα、PA28γ潜在临床价值的发掘奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织标本 收集35例中南大学湘雅医院自2015年7月—2016年8月收治的胃癌患者癌组织以及距肿瘤边缘约2 cm癌旁正常组织，每例患者手术后30 min内取新鲜组织标本，并迅速转移至液氮中保存。所有患者术前均未行化学治疗、放射治疗以及其他针对肿瘤的治疗，其中女12例，男23例；年龄分布32～75岁，中位年龄54岁；未分化和低分化者30例，中分化和高分化者5例；按照AJCC第7版TNM分期标准分期：I～II期10例，III～IV期25例；肿瘤≥5 cm者18例，＜5 cm者17例；T1/T2期者5例，T3/T4期者30例；淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者11例。所有患者均知情同意，本研究经医院伦理委员会审批。

1.1.2 细胞与实验动物 胃癌细胞株AGS由中南大学湘雅医院中心实验室提供。裸鼠BALB/c-nu，全为雄性，4周龄，体质量18～22 g，由中南大学动物实验中心提供，共6只，SPF级条件下饲养,标准实验室食物，自由饮水。

1.1.3 主要试剂与耗材 培养液RPMI1640、胰蛋白酶、TRIzol试剂、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；DAB显色试剂盒购自瑞士Roche公司；BCA试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）明胶、嘌呤霉素、碘化丙啶（PI）以及核糖核酸酶A（RNase A）购自美国Sigma公司；PCR试剂盒、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司；引物由上海生物生工公司合成；LXRα抗体，二抗均购自英国Abcam公司；PA28γ抗体，二抗均购自美国CST公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；6孔细胞培养板购自美国Corning公司；其他各种化学试剂均为国产分析纯产品。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理 标本各取部分由10%福尔马林固定，常规行石蜡包埋。蜡块切片后行免疫组织化学染色。所有石蜡标本行连续切片，片厚4 μm，共4张。1张作常规HE染色，2张作LXRα、PA28γ免疫组化染色，1张以PBS液代替一抗作为阴性对照。随机抽取15例胃癌患者术后新鲜标本进行qRT-PCR。

1.2.2 免疫组织化学及评分标准 石蜡标本4 μm厚连续切片，常规脱蜡以及水化，3%双氧水室温下15 min灭活内源性过氧化物酶，于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中用微波法进行抗原修复，冷却后PBS漂洗3次。然后使用5%的牛血清白蛋白（BSA）封闭，滴加一抗，4 ℃条件下过夜。接着滴加生物素化山羊抗兔二抗，37 ℃孵育20 min。之后使用辣根过氧化物酶DAB显色试剂盒于室温下显色，蒸馏水洗涤。用苏木精复染5 min。以细胞核出现淡黄色至棕褐色判为阳性。使用低倍镜观察整个切片，随机取10个视野，切换高倍镜观察细胞染色情况；结合阳性细胞百分率和染色强度进行免疫组化评分。结果判定参照相关文献[10]：阳性细胞百分数为0评为0分；＞0～＜10%为1分；10%～50%为2分；＞50%为3分。染色深度计分：阴性为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。按“阳性细胞×染色深度”计总分，0～3分为阴性，4～6分为中度阳性，＞6分为强阳性。所有染色结果的判定都采用双盲法和统一评分标准，在完全不知对应样本临床资料的前提下，由2名研究者分别对免疫组织化学结果进行评分，所有打分过程都重复3次以上。

1.2.3 细胞培养 人胃癌AGS细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养，用25 cm2培养瓶置于5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。细胞铺满80%培养瓶时，胰酶消化后1 000 r/min离心5 min，进行1:3传代培养。

1.2.4 过表达LXRα慢病毒构建和转染 过表达LXRα的重组慢病毒颗粒-LV-NR1H3（25063-1）由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。根据厂家说明书进行慢病毒转染，经过嘌呤霉素筛选后得到稳定转染细胞株。

1.2.5 qRT-PCR 分别提取新鲜胃癌与癌旁组织、各组皮下成瘤瘤体以及体外实验各组细胞中的总RNA，将1 μg总RNA依照反转录试剂盒中的操作步骤反转录成cDNA。采用SYBR Green法进行qRT-PCR，引物序列见表1。ΔCT=CT（目的基因，待测样本）-CT（内标基因，待测样本）（表1）。

表1 引物序列Table 1 The sequences of gene primers

1.2.6 Western blot 分别提取各组皮下成瘤瘤体以及体外实验各组细胞中的总蛋白。使用二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度。取各组蛋白样品30 μg在100 ℃下加热变性后上样，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）电泳分离后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h，相应的一抗4 ℃条件下孵育过夜、使用洗涤缓冲液(TBST)洗膜3次，每次10 min，室温下孵育二抗1 h，洗膜3次，每次10 min。使用Bio-Rad凝胶成像分析系统显影、拍照。采用Image J软件进行条带灰度分析，以目的蛋白与内参的灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期 将AGS细胞分为过表达组（过表达LXRα慢病毒载体转染）和空白对照组（无处理），常规方法计数并收集细胞（约2×106），1×PBS洗涤1次（1 000 r/min，5 min）。预冷75%乙醇固定，4 ℃孵育过夜。弃去 75% 乙 醇，1×PBS洗 涤 1次（1 000 r/min，5 min）。重悬细胞于 800 µL 1×PBS+1%BSA 溶液中，加入100 µL PI染液，加入100 µL RNA酶，37 ℃避光孵育30 min，上机检测。检测前预热30 min后荧光微球调整机器，使各放大器接收信号的HCV值＜2%，采用Cell Modifit软件进行分析。细胞增殖指数=（S+G2/M）/（S+G2/M+G0/G1）。

图1 LXRα和PA28γ mRNA在胃癌和癌旁组织中的相对水平Figure 1 The relative expression levels of LXRα and PA28γ mRNA in gastric cancer and adjacent tissue

1.2.8 裸鼠皮下成瘤 将裸鼠随机分为过表达组（移植过表达LXRα的AGS细胞）和空白对照组（移植无处理的AGS细胞），每组3只。取各组对数生长期的胃癌细胞株用胰蛋白酶消化，用RPMI1640培养液稀释成单细胞悬液，通过台盼蓝染色测定细胞活力后,用冰生理盐水离心洗涤2次,悬浮于生理盐水中，调整细胞浓度为1×108个/mL。将裸鼠左侧腋窝处皮肤用75%酒精消毒，使用1 mL注射器抽取细胞悬液0.1 mL接种于左侧腋窝处皮下。观察期结束后用颈椎脱臼法处死裸鼠，无菌条件下完整剥离瘤体，称重。30 min内转移至液氮中保存，供后续实验使用。

1.3 统计学处理

使用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行统计分析，计数资料使用χ2检验和Kruskal-Wallis H检验，相关性检验使用Spearman等级相关分析，计量资料使用t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌手术标本中LXRα与PA28γ的表达

2.1.1 LXRα 与 PA28γ mRNA的 表达 qRTPCR结果显示，与内参GAPDH相比较，LXRα在15例胃癌组织中的ΔCT值为6.81±1.48，在癌旁组织中的ΔCT值为5.61±1.23。即LXRα mRNA在胃癌组织中的水平低于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.0314）。PA28γ在15例胃癌组织中的ΔCT值为7.11±2.91，在癌旁组织中的ΔCT值为 8.90±1.20。即 PA28γ mRNA在胃癌组织中的水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.041 4）（图1） 。

2.1.2 LXRα和PA28γ蛋白的表达及其临床病理因素的关系 免疫组织化学结果显示，LXRα在胃癌组织以及癌旁组织中表达的阳性率分别为68.6%（24/35） 和 91.4%（32/35），即 LXRα在胃癌组织中的表达低于癌旁组织（P=0.034）。PA28γ在胃癌组织以及癌旁组织中表达的阳性率分别为 60.0%（21/35）和 31.4%（11/35），即PA28γ在胃癌组织中的表达高于癌旁组织（P=0.030）（图2）（表2）。LXRα与PA28γ蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小、浸润深度、有无淋巴结转移均无明显关系（均P＞0.05）（表3）。

图2 免疫组化检测PA28γ和LXRα蛋白表达（×400） A：胃癌中PA28γ阳性；B：癌旁中PA28γ阴性；C：胃癌中LXRα阴性；D：癌旁中LXRα阳性Figure 2 Immunohistochemical staining for PA28γ and LXRα protein expressions (×400) A:Positive PA28γ expression in gastric cancer tissue; B: Negative PA28γ expression in tumor adjacent tissue; C: Negative LXRα expression in gastric cancer tissue; D: Positive LXRα expression in tumor adjacent tissue

表2 LXRα和PA28γ蛋白在胃癌及其癌旁组织中的表达比较[n（%）]Table 2 Comparison of LXRα and PA28γ protein expressions in gastric cancer and adjacent tissue [n (%)]

表3 LXRα与PA28γ蛋白的表达与胃癌临床病理特征的关系[n（%）]Table 3 The relations of LXRα and PA28γ protein expressions with the clinical factors of gastric cancer [n (%)]

2.1.3 LXRα与PA28γ蛋白表达的相关性 免疫组织化学结果显示，35例胃癌组织中，LXRα蛋白强阳性者9例，中等阳性者15例，阴性者11例。PA28γ蛋白强阳性者5例，中等阳性者16例，阴性者14例。经Spearman等级相关分析显示，LXRα和PA28γ蛋白在胃癌中的表达呈负相关（r=-0.452，P=0.006）（表4）。

表4 胃癌组织中LXRα和PA28γ蛋白表达的相关性Table 4 Correlation between LXRα and PA28γ protein expressions in gastric cancer tissue

2.2 细胞实验结果

2.2.1 转染效率检测以及过表达LXRα对PA28γ表达的影响 用qRT-PCR检测空白对照组AGS细胞和过表达组AGS细胞中PA28γ mRNA相对水平，结果显示，过表达组LXRα mRNA的相对水平为空白对照组的（26.507±3.016）倍。同 时 用qRT-PCR与Western blot检 测PA28γ mRNA与蛋白的表达，结果显示，与空白对照组比较，过表达组PA28γ的mRNA与蛋白的表达水平均明显下降（P=0.006 8、P=0.001 0）（图3）。

2.2.2 过表达LXRα对体外AGS细胞细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，过表达组细胞处于亚G0期以及G0/G1期比例高于空白对照组；而S期和G2/M期细胞比例均低于空白对照组（均P＜0.05）。LXRα过表达组增殖指数为0.433±0.003，明显低于空白对照组的0.526±0.001（P=0.000）（图4）（表5） 。

图3 PA28γ表达检测 A：mRNA表达；B：蛋白表达Figure 3 Determination of PA28γ expression A: mRNA expression; B: Protein expression

图4 流式细胞仪检测细胞周期变化Figure 4 Flow cytometric analysis of cell cycle

表5 周期相关指标的比较Table 5 Comparison of cell cycle-related variables

2.3 动物实验结果

2.3.1 移植瘤生长情况 空白对照组和过表达组的裸鼠在接种后7 d左右皆可见接种部位皮下长出约米粒大小硬结，成瘤率为100%。肿瘤随着时间的推移呈不同速度生长。接种24 d后处死裸鼠，取出肿瘤组织称重。过表达组和空白对照组肿瘤质量分别为（0.475±0.099）g、（2.295±0.178）g，过表达组肿瘤质量明显轻于空白对照组（P=0.000 9）（图5）。

图5 接种24 d后小鼠皮下移植瘤情况 A：过表达组；B：空白对照组Figure 5 The subcutaneous xenografts in mice 24 d after transplantstion A：LXRα overexpression group; B: Blank control group

2.3.2 移植瘤组织中LXRα与PA28γ水平 用qRT-PCR检测两组皮下移植瘤中LXRα和PA28γ mRNA的相对水平，结果显示，与空白对照组比较，过表达组PA28γ mRNA水平明显下调（P=0.001 8），LXRα mRNA水平明显上调（P=0.001 1）。用Western blot检测两组皮下移植瘤中LXRα和PA28γ蛋白的相对水平，结果显示，与空白对照组比较，过表达组PA28γ蛋白表达水平明显下调（P=0.001 4），LXRα蛋白表达水平明显上调（P=0.002 0）（图6） 。

图6 LXRα和PA28γ在皮下移植瘤组织中的表达检测 A：mRNA表达；B：蛋白表达Figure 6 Determination of the expression levels of LXRα and PA28γ in the transplanted tumor tissue A: mRNA expressions; B: Protein expressions

3 讨 论

胃癌是世界常见肿瘤，在我国恶性肿瘤中发病率居第2位，病死率居第3位[1-2]。近年来，随着D2根治术为主的规范手术的推广，以及合理的术后化疗，胃癌患者生存率有一定程度的提高，但其整体治疗效果依然不佳。除了传统的手术治疗以及新辅助化疗，胃癌的靶向治疗同样发展迅速。无数胃癌发生、发展的驱动基因被识别，受到学界的关注，而LXRα则是近年来恶性肿瘤增殖研究的热点基因。

LXR是DNA结合转录因子核受体家族的成员，有LXRα和LXRβ两种亚型。LXRβ广泛分布于全身各个组织，而LXRα主要分布在肾上腺、小肠、脂肪、肝脏等代谢活跃的组织或器官中[11-12]。近年来的研究发现LXRα与多种肿瘤的发生、发展相关，且在多种肿瘤中发挥抑癌作用。蛋白酶体激活剂PA28γ，又名REGγ、PSME3、11Sγ、Ki抗原[13]。PA28γ是REG蛋白酶体激活因子家族（也称11S家族）中的一员，11S家族还包括PA28α（REGα）和PA28β（REGβ）。这些成员可以在不依赖ATP和泛素的情况下激活20S蛋白酶体的裂解活性[9]。目前，PA28γ被认为在多种肿瘤中发挥促癌作用[9,13-14]。

本研究首先在胃癌和癌旁组织中运用免疫组织化学方法和qRT-PCR检测LXRα与PA28γ的表达。结果显示，LXRα在胃癌组织中的蛋白和mRNA水平低于癌旁组织，PA28γ在胃癌组织中的蛋白和mRNA水平高于癌旁组织。Vigushin等[15]发现：15例乳腺癌中LXRα mRNA的阳性率为11/15（73.3%），低于正常组织的14/15（93.3%）。PA28γ在人体正常组织中多为低表达，而在喉癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中高表达[16-18]。这与本研究结果相一致。在进一步的实验中，通过流式细胞术和动物实验发现，LXRα对人胃癌细胞株AGS的细胞周期具有阻滞作用，并能抑制AGS细胞的生长。大量文献[19-23]报道了类似结果：LXR在结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中起抑癌作用。免疫组化研究中发现：胃癌组织中LXRα蛋白与PA28γ蛋白的表达存在明显负相关，提示LXRα与PA28γ之间可能存在联系。随后本研究通过Western blot和qRT-PCR发现：过表达LXRα可显著下调体内外AGS细胞中PA28γ的表达。近年的研究提示：PA28γ具有促癌作用。Guo等[17]发现在胰腺癌中PA28γ通过c-Myc-glycolysis信号轴促进胰腺癌生长。Chen等[16]发现PA28γ通过Wnt/β-catenin通路促进黑色素瘤增殖；阻断和敲除PA28γ能够抑制体内外黑色素瘤细胞增殖。进一步查阅文献发现PA28γ可特异性降解p53[23]。p53是一种重要的抑癌基因[24]，而特异性降解p53被认为是PA28γ发挥促癌作用的重要途径之一。已有文献[25]报道，激动LXRα后p53的表达上调。综上所述，我们提出以下观点，即LXRα可抑制人胃癌细胞的生长，并且其机制之一可能是通过抑制PA28γ的表达，进而上调抑癌基因p53的表达，最终达到抑制肿瘤的作用。

在本研究中，LXRα在胃癌组织中相对低表达，在癌旁组织中相对高表达，并且抑制胃癌AGS细胞的生长，起抑瘤作用，这与LXRα在其他肿瘤中的作用是基本一致的。PA28γ在胃癌组织中相对高表达，在癌旁组织中相对低表达，这与其在其他肿瘤中的表达也基本一致。而LXRα与PA28γ的负相关作用则是首次报道。在其他肿瘤中是否也存在类似现象，还需进一步实验证明。但无论如何，LXRα的抑癌作用正逐步被揭示，有望成为胃癌靶向治疗的一个新靶点。