微量植物组织汁液直接RT-LAMP可视化检测马铃薯卷叶病毒方法的构建

李 姣， 朱晓换， 古 蕾， 王亚男

（四川师范大学生命科学学院，四川成都610101）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上仅次于大米、小麦和玉米的第4大粮食作物.马铃薯易受病毒感染，马铃薯病毒严重影响其产量和品质.其中马铃薯卷叶病毒是最具破坏性的马铃薯病毒，普遍分布在世界（包括中国）大多数马铃薯种植地区［1］.马铃薯卷叶病毒（PLRV）是黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的代表成员，通过蚜虫传播.PLRV侵染马铃薯植株，引起卷叶、黄化、矮缩、僵化及块茎网状坏死等症状，导致马铃薯严重减产，重者减产80%以上.

大规模组织培养无病毒种薯生产是控制马铃薯病毒病的主要方法，然而优良无病毒种薯的生产要求建立快速、准确、灵敏的可应用于大规模样本的病毒检测技术.目前马铃薯病毒检测的方法主要有酶联免疫检测（ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）2种.ELISA因为操作简单而被广泛应用于马铃薯病毒检测，然而，灵敏度较低和假阴性结果的干扰等缺点大大限制了其检测的准确性［2］.RT-PCR比ELISA更敏感，也常用于马铃薯病毒检测［3-5］.然而，RT-PCR检测过程需要4个步骤，先后分别是：1）从植物组织中提取RNA；2）逆转录反应（RT）；3）聚合酶链反应（PCR）；4）通过琼脂糖凝胶电泳成像可视化其反应产物.因此，RTPCR的过程复杂且耗时，使其不能满足对大规模样本进行快速病毒检测的要求.逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）［6-11］是一种用具有链置换活性的 Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶以逆转录所得的cDNA为模板，通过2对（或3对）引物于65℃（Bst DNA聚合酶的最适温度）恒温条件下扩增的技术.其扩增产物为大小不一的DNA片段.同时伴随DNA的合成产生大量焦磷酸根离子，该离子与反应液本身所含有的镁离子结合形成肉眼可视的白色沉淀——焦磷酸镁［6-8］.RT-LAMP反应只需1个恒温水浴锅，在1 h内完成，因此是一种简单、快速和成本低的马铃薯病毒检测方法.然而，在RT-LAMP检测中，制备RNA模板不仅是检测的第一个步骤，也是保证检测结果准确的基础［8］.目前主要使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法等方法从待测植物样品中提取总RNA作为RT-LAMP扩增的模板，这些方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚、氯仿等试剂易对环境造成污染.在对大规模样本进行病毒检测的过程中，RNA模板的提取已成为检测过程中耗时耗力最多的一个环节.本研究将无菌大头针的针尖刺感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯植株的茎尖，用粘附在针尖处的微量植物组织汁液直接进行RT-LAMP扩增.由于植物组织汁液中含有微量的马铃薯卷叶病毒RNA，此RNA是RT-LAMP扩增用的模板.其扩增产物通过肉眼观察便可检测出该植株有无感染PLRV，从而建立一种无需RNA模板制备，无需琼脂糖凝胶电泳成像或荧光显色，快速检测PLRV的方法.该方法大大减少了检测时间和成本，且操作简便，应用于对大规模样本的病毒检测，在大规模组织培养无病毒种薯生产中有很大的应用空间.本研究之所以采用马铃薯茎尖提取微量组织汁液，原因有2点：1）高细胞密度的茎尖可以使足够量的组织汁液粘附在针尖处；2）植物细胞含有干扰 RTLAMP和RT-PCR反应的抑制剂，而茎尖细胞含有的抑制剂较少，能减少对RT-LAMP和RT-PCR反应的干扰.

1 材料与方法

1.1 供试植株 实验所用植株为培养室中生长的马铃薯组培苗，其品种为“紫花白”.待测样品包括经ELISA法鉴定已感染PLRV的6份样品和没有感染PLRV的6份样品.阳性对照：已感染PLRV的马铃薯组培苗；阴性对照1：没有感染PLRV的马铃薯组培苗；阴性对照2：以ddH2O为模板的RTPCR或RT-LAMP扩增产物.

1.2 实验试剂 植物组织总RNA提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；5X TRUE RT MasterMix逆转录反应试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）、Moloney Murine Leukemia Virus（MMLV）逆转录酶（美国Promega公司）、2X Utaq PCR MasterMix试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶（美国 New England Biolabs公司）、10X ThermoPol反应缓冲液（美国 New England Biolabs公司）、RNase抑制剂（美国Promega公司）、甜菜碱（美国Sigma公司）；琼脂糖和Goldview核酸染料（均购自北京中科瑞泰生物科技有限公司）、DL2000 DNA相对分子质量标准和6X上样缓冲液（均购自南京生兴生物技术有限公司）.

1.3 引物 本研究中检测的PLRV的基因为PLRV外壳蛋白的编码序列（ORF3），共627个碱基对（bp）.RT-PCR和RT-LAMP反应所用的引物及引物序列和当有PLRV感染植株时扩增的目的片段如表1所示.所有引物均由成都擎科生物技术公司提供.表1中RT-PCR反应所用的引物为正向引物F和反向引物B，当有PLRV感染植株时，其反应产物经琼脂糖凝胶电泳后表现为一条长627 bp的条带.RT-LAMP反应所用的引物为1对外引物（F3／B3）和1 对内引物（FIP／BIP），当有PLRV 感染植株时，其反应产物经琼脂糖凝胶电泳后表现为瀑布状的DNA片段.

表1 RT-PCR和RT-LAMP反应中所用引物的序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-PCR and RT-LAMP

1.4 实验仪器 Bio-Rad PCR仪 C1000（美国Bio-Rad公司）；Bio-Rad水平15×10 cm Sub-Cell GT电泳槽1704481（美国Bio-Rad公司）；Bio-Rad Powerpac Basic基础电源1645050（美国Bio-Rad公司）；Bio-Rad凝胶成像系统 SYSTEM GelDoc XR+（美国Bio-Rad公司）；HH-6恒温水浴锅（常州朗博仪器制造有限公司）.

1.5 实验方法

1.5.1 植物组织总RNA提取 按照传统的RNA模板的制备方法，将剪下的茎尖组织（长约0.1 cm）放入事先盛有液氮的研钵中，充分研磨，然后按照北京庄盟国际生物基因科技有限公司提供的植物组织总RNA提取的说明书，用该公司提供的植物组织总RNA提取试剂盒进行操作.

1.5.2 微量组织汁液采集 如图1所示，使用无菌大头针的针尖刺马铃薯组培苗（苗高6～8 cm）茎尖，茎尖汁液随之粘附在针尖处.在RT-PCR实验中，先将针尖浸在逆转录（RT）反应液中，通过随机引物，总RNA（PLRV和马铃薯的RNA）被逆转录为总 cDNA，然后转移适量 RT反应液（总量为0.5μg DNA）到PCR反应液中，通过1对引物（表1中F／R），病毒DNA被扩增为长627 bp的片段.在RT-LAMP实验中，将针尖浸在反应液中，由于植物组织汁液中含有微量的马铃薯卷叶病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反应液中先被M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶通过2对引物（表1中 F3／B3和 FIP／BIP）扩增.其扩增产物为大小不一的DNA片段.同时伴随DNA的合成产生大量焦磷酸根离子，该离子与反应液本身所含有的镁离子结合形成肉眼可视的白色沉淀——焦磷酸镁［6-8］.如有白色沉淀，即可判定为带PLRV植株；如没有白色沉淀的出现，即可判定为无病毒植株.

图1 微量组织汁液采集示意图Fig.1 Illustration of collecting micro-tissue juice

1.5.3 RT-PCR RT-PCR 反应首先对传统法提取的RNA模板或者微量组织汁液中含有的RNA进行RT反应，然后对RT反应产物进行PCR扩增.

传统的RT反应体系的总体积为20μL，其中各成分含量为：1μg RNA和4μL 5X TRUE RT Master-Mix（该试剂包含M-MLV逆转录酶和一对随机引物）.各成分配置完成后，以双蒸水补齐至20μL，于42℃恒温反应20 min，获得DNA模板，随后于85℃放置5 s，使逆转录酶失活，终止反应.

微量组织汁液直接RT反应体系总体积为20μL，成分同传统的 RT反应体系，只是不加RNA，以双蒸水补齐至20μL.将粘附了茎尖汁液的针尖浸在RT反应体系中，室温中反应15 min，获得DNA模板，随后于85℃放置5 s，使逆转录酶失活，终止反应.操作中，尽量使粘附了茎尖汁液的针尖完全浸在RT反应体系中，并盖严管盖，否则会影响RT反应结果.

PCR反应体系总体积为25μL，其中各成分含量为：12.5 μL 2X Utaq PCR MasterMix、10 μM 正反向引物各1μL、0.5μg DNA模板.各成分配置完成后，以双蒸水补齐至25μL，放入Bio-Rad PCR仪中进行PCR扩增.PCR反应条件包括：1）预变性：94 ℃，3 min；2）30 个循环：94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s；3）末次延伸：72 ℃，7 min.其反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测.

1.5.4 RT-LAMP 传统的RT-LAMP反应体系总体积为25μL，其中各成分含量为：1.6μM内引物 FIP／BIP、0.4 μM外引物 F3／B3、2.5 μL 10X ThermoPol缓冲液、0.8 M betaine、1.0 mM dNTP、8 mM MgSO4、10 U M-MLV 逆转录酶、4 U RNase抑制剂、10 U Bst DNA聚合酶和0.1μg DNA模板.各成分配置完成后，以双蒸水补齐至25μL，于65℃恒温反应60 min，随后放置于80℃ 5 min，使逆转录酶失活，终止反应.

微量组织汁液直接RT-LAMP反应体系总体积为25μL，其中各成分含量同传统的RT-LAMP反应体系，只是不加DNA模板，以双蒸水补齐至25μL.将粘附了茎尖组织汁液的针尖浸在RTLAMP反应体系中，于65℃恒温反应60 min，随后于85℃放置5 s，使逆转录酶失活，终止反应.操作中，尽量使粘附了茎尖组织汁液的针尖完全浸在RT-LAMP反应体系中，并盖严管盖，否则会影响RT-LAMP反应结果.

1.5.5 质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳成像 将0.45 g的琼脂糖放入30 mL 1X TAE缓冲液中溶解，滴入1.5μL Goldview核酸染料（比例：5μL核酸染料／100 mL 1X TAE缓冲液），倒入胶模中，室温静置约30 min，使胶完全凝固.把胶放入装有适量1X TAE缓冲液的Bio-Rad凝胶电泳仪的电泳槽内，分别往孔道中加入6μL DL2000 DNA相对分子质量标准和6μL RT-PCR或RT-LAMP反应产物的混合液（比例：1μL反应产物／5μL 6X上样缓冲液）后，盖上电泳槽，通电1～5 V／cm，使DNA向阳极移动.电泳完毕后，取出凝胶，在Bio-Rad成像系统中检查凝胶并拍照.

2 结果与讨论

2.1 微量植物组织汁液直接RT-LAMP可视化检测马铃薯卷叶病毒方法的建立 大规模组织培养无病毒种薯，能大大减少马铃薯卷叶病毒对生产的危害，然而，在其生产过程中尤为需要对大规模样本进行快速的病毒检测.因此，本研究构建了微量植物组织汁液直接RT-LAMP可视化检测马铃薯卷叶病毒方法，即用无菌大头针刺马铃薯植株的茎尖，将粘附了组织汁液的针尖浸在RT-LAMP反应液中，于65℃恒温反应60 min.由于植物组织汁液中含有微量的马铃薯卷叶病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反应液中先被M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶在针对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因ORF3的2对引物（表1中F3／B3和 FIP／BIP）作用下进行扩增.其扩增产物为大小不一的DNA片段（见图2B中的瀑布状片段）.同时伴随DNA的合成产生大量焦磷酸根离子，该离子与反应液本身所含有的镁离子结合形成肉眼可视的白色沉淀-焦磷酸镁.如有白色沉淀，即可判定为带PLRV植株；如没有白色沉淀的出现，即可判定为无病毒植株.

2.2 微量植物组织汁液直接RT-LAMP可视化检测马铃薯卷叶病毒方法的可靠性 图2A：马铃薯茎尖直接RT-LAMP反应的肉眼观察所得的结果.PCR管+：阳性对照（已感染PLRV的马铃薯组培苗样品），反应液中出现白色沉淀；PCR管-：阴性对照（未感染PLRV的马铃薯组培苗样品），反应液清澈，无白色沉淀.图2B：质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳分析以微量组织汁液为模板直接RTLAMP法及RT-PCR法和以传统法提取的植物组织总RNA为模板的RT-LAMP法及RT-PCR法的实验结果.泳道M：DL2000 DNA相对分子质量标准；泳道W：以ddH2O为模板扩增的结果；泳道-：未感染PLRV的马铃薯组培苗样品的检测结果；泳道+：已感染PLRV的马铃薯组培苗样品的检测结果：1）以传统法提取的植物组织总RNA为模板扩增的检测结果；2）以茎尖汁液为模板直接扩增的检测结果.

由图2可知，微量组织汁液直接RT-LAMP检测PLRV的结果与以传统法提取的植物组织总RNA为模板的RT-LAMP检测PLRV的结果一致，说明微量组织汁液直接RT-LAMP检测马铃薯卷叶病毒的方法是可靠、可行的.通过肉眼观察反应产物中有无白色沉淀来判定植株是否感染病毒的方法与琼脂糖凝胶电泳分析法的结果一致，说明通过肉眼观察反应产物中有无白色沉淀来判定植株是否感染病毒的方法是可靠、可行的.

图2 利用引物对PLRV ORF3序列进行RT-PCR和RT-LAMP扩增的结果Fig.2 Amplification results of PLRV ORF3 sequence using primers in RT-PCR and RT-LAMP

3 结束语

该方法不仅限于对马铃薯卷叶病毒的检测，还可通过设计针对其它病毒靶基因序列的引物，应用于其它病毒（如水稻黑条矮缩病毒［12］、草莓轻型黄边病毒［13］）的检测中.该方法与以往的检测方法相比，具有以下3个优点.1）迅速：该方法无需RNA提取，无需琼脂糖凝胶电泳成像或荧光显色，减少了至少2～3 h的检测时间；2）操作简便：RNA提取和琼脂糖凝胶电泳成像的操作难度较大，需要具备一定操作技能的人员经过一段时间反复试验才能掌握其操作技术.该方法无需RNA提取和琼脂糖凝胶电泳成像，操作十分简便，任何人员都可迅速掌握其操作技术；3）成本低：RT-PCR检测法需要PCR仪，然而一个价格最低的PCR仪花费上万元.RT-PCR和RT-LAMP的反应产物需要琼脂糖凝胶电泳成像进行检查和分析，然而价格最低的电泳仪和成像系统花费上万元.该方法只需要一个任何实验室都具备的仪器——恒温水浴锅，因此大大减少了检测成本.虽然该方法灵敏度不及RTPCR（如图2B所示），但其所具有的3个优点使其适用于对大规模脱病毒样本的病毒检测，在大规模组织培养无病毒种薯、花卉和苗木生产中具有很大的应用空间，而且它适用于任何一个植物病毒检测机构，特别是实验设备相对简单、操作人员技能相对有限的基层机构.