品管圈活动在自动免疫组织化学仪进行原位杂交中的应用

脱颖，蔡炳，何琼，李淑华，周建文，梁英杰

（中山大学附属第一医院，广州510080）

随着医改的不断深入，患者对医疗服务需求的日益增加，对医院医疗质量管理和服务水平提出了更高的要求，探索科学的质量管理工具亟待突破。作为全面质量管理的工具，品管圈是1962年由日本引进医院管理，并且逐步得到业内肯定，随后由台湾引进大陆。品管圈（quality control circle，QCC）是指同一工作现场或工作相互关联区域的人员自动自发地进行品质管理活动所组成的小组，其优点是有利于发挥每个人的创造性思维、激发医务人员的积极性，提高医务人员寻找问题和解决问题的能力，提高工作效率，提升医疗服务质量和患者满意度，强化团队意识，养成持续不断质量改善的组织文化和气氛［1-3］。

近年，随着免疫组织化学原位杂交技术在病理诊断中的应用日益广泛，该项目的开展已成为常规病理诊断中不可缺少的重要检测手段。但由于原位杂交步骤多，每一步都有可能影响实验结果，对相同的原位杂交探针会因为不同的实验室操作程序、操作人员素质的高低而导致实验结果有所差异[4]，因此应用品管圈质控自动免疫组化仪行原位杂交的整个过程，将原位杂交的操作标准化，提高原位杂交的成功率及染色质量，可为患者提供更全面更精准的医疗诊断。

材料和方法

1 资料

科室使用Leica BOND-MAX全自动免疫组织化学染色仪执行原位杂交项目。选择2016年7月1日至12月31日执行的原位杂交项目415例为对照组（活动前），选择2017年1月1日至6月31日执行的原位杂交项目471例为实验组（活动后），对开展品管圈活动前后两组所有原位杂交项目质控染色质量、统计重做率，并进行比较研究。对原位交质量不佳或失败的原因进行分析，制定相应的整改措施并组织实施。

2 方法

2.1 成立品管圈小组

我科按照自愿参加的原则由6名分子实验室相关成员组成一个圈，选出圈长一名，副圈长及秘书各一名。小组旨在规范自动免疫组化仪行原位杂交的流程、提高原位杂交质量，组内每 2～4 周组织讨论 1 次，主要内容包括工作制度落实和不断完善、原位杂交流程改进和杂交失败原因的分析、质量监控方法、机器维修与保养、安全管理、新探针的应用等项目。用Plan、Do、Check、Action（PDCA）循环来保证质量的持续改进，以提高成功率。

2.2 制定计划

如果原位杂交失败率较高或质量不佳，便需要重复实验，这样既增加工作负担又增加成本，更重要的会延迟发出报告的时间，延误病人治疗时机，甚至还会引起医疗纠纷，给科室带来负面影响，因此降低原位杂交失败率和提高制片质量是关键。规范流程以提高质量是 PDCA第一步的计划阶段。

2.3 调查现状

目前我科开展的原位杂交项目主要有5项：EBER、CMV、HPV、Kappa和Lambda，由QCC圈员对2016年7月至2016年12月活动前以及2017年1月至2017年6月活动后的原位杂交总数及重做数目进行统计。统计结果见图1。

图1 QCC活动前后原位杂交重做数的数据统计Fig. 1 Statistics of rework numbers of in situ hybridization before and after QCC application

3 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件进行百分率比较并行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原位杂交染色质量调查结果

调查后发现活动期间存在缺陷并重做的切片为34张（活动前23张及活动后11张），活动前后重做率分别占总数的5.54% 及2.33%。进行因果分析后找出造成这些原位杂交失败的主要原因为组织掉片、染色仪因素、试剂因素以及人为因素，随后分别对以上因素进行鱼骨图分析（图2）。

2 原位杂交失败原因

2.1 掉片是造成原位杂交实验失败的主要原因

良好的组织制片是正确判断原位杂交结果的前提和基础，因此掉片是造成原位杂交实验失败的主要原因。追溯掉片玻片的原因，发现外院送检的会诊玻片或会诊蜡块约占85%左右。原位杂交中，标本的固定是影响杂交效率的重要因素。部分送检医院尤其基层医院的组织玻片，可能因组织离体后固定不及时，固定液浓度、时间和量不规范，大标本未切开固定过夜等原因均可导致固定液渗透不完全造成蜡块或切片质量不佳。脱水流程不规范等是造成原位杂交过程中组织掉片和质量不高的另一个主要原因；也有少数因为玻片未进行防脱处理或防脱效果不佳，机器较强力的冲洗力造成组织完全或部分掉片，影响观察；此外，组织性质也会造成组织掉片，例如骨组织、少量皮肤组织等也会偶尔掉片造成原位杂交失败（图3A、B）。

图2 原位杂交失败原因“鱼骨图分析”Fig. 2 “Fish bone diagram analysis” of the failure causes of in situ hybridization

2.2 机器故障是造成原位杂交批次失败的主要原因

首先，适宜的实验室温度和湿度保障实验成功的环境因素。室温过低会影响抗原与抗体的结合，导致假阴性；温度过高，建议适当缩短时间，同时增加空气湿度。其次，若自动免疫组织化学仪长期未维护，盖子划痕或变形导致试剂滴在Covertile之上或外漏在间隔槽内，或因为探针针管吸样时清洗不完全造成部分堵塞，会使吸入抗体量减少，导致待杂交组织全部或者部分“空染”等，均会导致杂交效果差、甚至部分或者全部实验失败（图3D、E）。

2.3 试剂不合格是造成原位杂交效果差的主要原因

若试剂保存不当，未严格按照抗体说明书要求进行试剂存放，或使用存放过久超过试剂保质期的试剂均会造成阳性结果定位弱、定位不正确或不表达，染色背景深等。此外，试剂配置不标准，也会造成实验结果不稳定甚至实验失败（图3D、E）。

2.4 个人工作能力和业务水平的差异也会造成原位杂交失败

由于工作疏忽，软件操作过程中，原位杂交项目或原位杂交条件未选择正确、 Covertile塑料罩盖反方向甚至忘记加盖等造成试剂未完全覆盖铺散到玻片的规定区域、未确保试剂均匀分布到组织的表面，导致原位杂交显色“阴阳脸”(图3C)；或没有及时倾倒废液等都会造成原位杂交失败或者质量不佳，影响诊断。

3 统计学分析结果

对品管圈活动前后结果进行统计学分析，数据显示品管圈活动前后，原位杂交染色质量得到一定程度提高，以EBER为例，染色获得满意效果（图3F）。活动后重做率（2.33%）较活动前（5.54%）明显降低（表1）。

讨 论

随着精准医疗的逐渐推广，分子病理检测逐渐成为病理科常规项目，其诊断结果将直接指导患者治疗或提示患者预后，这就要求我们重视分子病理的质量控制和标准化。本研究以规范流程管理标准化为中心，开展“品管圈”活动后，针对科室自动原位杂交操作过程中所出现的问题每2～4周由“圈长”组织“品管圈”活动小组就免疫杂交过程中存在的质量问题进行回顾讨论1次，并制定改进计划，分析原位杂交失败及染色效果不佳原因，找出了解决问题的4个关键环节并做出相应改进。

首先，严格规范科室内标本固定和脱水包埋整个流程的情况，对外院送检的玻片和蜡块进行严格把关，以降低失败率。其次，严格对机器进行定期维护保养和清洗。每日运行仪器前检查大瓶溶液的仓位，确认液体量足够本批次实验运行。原位杂交结束后，用4%的84消毒液对Covertile进行浸泡过夜，次日用蒸馏水清洗干净后晾干。每三百张切片染色后，运行清洗系统维护机器探针；每三千张组织切片后，及时检查并调整杂交探针加样位置，以确保染色仪保持良好的工作状态及工作效率和染色结果；每天根据各项目原位杂交张数及时调整工作液的量; 若在原位杂交过程中，软件操作界面提示试剂量不足，需立即补充超过瓶底最大底径的试剂，以保证吸液头完全插入试剂内，从而避免因试剂过少而吸入空气，导致无试剂吸出，出现假阴性结果。再次，合理设置对照实验。原位杂交过程添加阳性对照和阴性对照实验，排除探针失效可能。定期对库存探针，尤其是平时用量较少的探针进行排查，观察是否失效；对用量较大的试剂检查库存及时订购。经常与诊断医师交流，探讨阳性表达及定位是否满意。如果探针使用过程中，长时间出现阳性结果不满意，必须重新进行阳性对照检测或重新进行预实验，选择最佳实验条件及实验方法。最后，定期对技术员进行培训和业务学习，培养员工认真负责的工作态度，强化团队意识，养成持续不断质量改善的组织文化和气氛。从而降低原位杂交失败率使原位杂交质量得到持续改进，为患者提供更全面更精准的医疗诊断。

图3 免疫组织化学染色仪行原位杂交常见染色问题。A和B，组织掉片及皱褶(比例尺，250μm)； C，染色“阴阳脸” (比例尺，500μm)；D，阳性细胞弱染色 (比例尺，100μm)； E，阳性细胞几乎阴性染色(比例尺，250μm)；F，自动免疫组化仪行EBER染色的强阳性表达(比例尺，100μm)Fig. 3 Common problems occurred in in situ hybridization using an automatic immunohistochemical staining instrument. A and B, tissue detachment and tissue folds (scale bar, 250μm); C, uneven staining (scale bar, 500μm); D, weak staining of positive cells (scale bar, 100μm); E, hardly detected staining of positive cells (scale bar, 250μm); F, strongly positive staining with EBER by in situ hybridization with automatic immunohistochemistry staining instrument (scale bar, 100μm)

表1 “品管圈”活动前后造成原位杂交失败的主要原因及数据比较Tab. 1 Comparison of main causes and data of in situ hybridization failure before and after QCC application

Bond Max是一台性能卓越的全自动免疫组化染色机，原位杂交的所有步骤都可以由Bond-Max自动完成，真正实现全自动操作。全自动操作不仅节省人力，也确保原位杂交质量恒定、不受人为因素干扰、操作标准化且原位杂交效果可重复性强。但全自动染色机也不是万无一失的，成功的原位杂交结果要做好每一张切片、保证染色仪得以正确使用及维护保养，还要求病理技术人员具有高度的责任感和精益求精的工作作风，需经常检查设备运行状况，对机器进行定期维护。注意操作中的各个细节，每次原位杂交实验结束后均要进行染色结果 “初审”，在显微镜下观察是否定位准确，发现问题及时调整和解决，这样才能为病理诊断提供可靠的依据[5,6]。

此次 “品管圈”活动开展明显增强了团队凝聚力。“品管圈”活动是全员参与的团队活动，可把科学管理和人性管理结合在一起，让员工自觉地参与活动，使自己享有更高的自主权、参与权 、管理权。开展“品管圈”活动后 ，组织成员集思广益对自动免疫组化仪操作过程中存在的缺陷进行原因分析，讨论制定改进措施，提高原位杂交质量。同时，通过定期讨论，提高了分析和解决问题的能力[7,8]。此外，技术员整体素质得以提高，“品管圈”活动充分体现了其具有教育性及自主性的特点。开展此项活动后，为了使原位杂交质量达到预期目标，技术员自觉参与专业知识、技能培训，使得自身专业知识牢固，同时注重同医师沟通与协调。医师在原位杂交阅片过程中，发现问题及时沟通，并进行优化改进[9,10]。

“品管圈”应用于自动免疫组织化学仪行原位杂交管理中的效果显著，团队合作意识因此得到加强，整体素质获得提高，这是一种无形效益，可持续提高组员创新能力及策划能力，但“品管圈”的开展也是一项具有挑战性、科学性、持续性的活动，本次活动尚存在一些问题仍需持续改进。故以后工作中仍需继续不断努力，提高染色满意度，从而推动科室原位杂交质量管理的不断进步。