圆窗途径内耳药物载体的研究现状

林寿凯 王军义

广东药科大学公共卫生学院

由于内耳结构位于颞骨内相对封闭，且与全身血液循环之间存在血-迷路屏障，因此经全身给药途径进入内耳的药物剂量极为有限，此外经全身给药也可能对身体其他器官造成不良反应，而内耳的局部给药相比全身给药具有高效，副作用小的特点[1]，故内耳局部给药越来越受到关注。内耳局部给药主要分为有创给药和微创给药，而有创给药可能对外耳道和中耳造成永久性损害，故微创给药具有广泛的研究价值和应用前景，其中圆窗给药途径是微创治疗方法的重要选项。圆窗是通过局部给药治疗内耳病变最重要的界面，研究表明不仅小分子药物能渗透通过圆窗膜进入耳蜗外淋巴液，微球粒径为1µm时也能穿过圆窗膜进入内耳，目前圆窗给药方法尚处于实验阶段，在临床应用之前，要克服的最重要的问题之一是开发针对目标部位的药物的智能送药系统，并在内耳中控制释放[2]，实现上述目标的重要条件之一就是圆窗途径药物载体的研究和选择。内耳局部给药的载体分为多种，包括病毒载体、纳米粒载体、蛋白质载体、原位凝胶等[2-4]。现就内耳药物载体及圆窗途径应用的相关研究综述如下。

1 病毒载体

病毒载体是利用病毒质粒构建目标基因的载体，可转染至目标细胞实现转基因功能，是内耳疾病基因治疗研究的重要工具。病毒载体具有较好的靶向性和高转导效率，但同时病毒载体具有一定的局限性，如无法转移大尺寸的基因，成本高等缺点[5]。常见的内耳基因病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒载体。

1.1 腺病毒载体

腺病毒是一种大分子双链无包膜DNA病毒，它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中；腺病毒载体是内耳基因治疗研究中最常用的病毒载体，基因容量为8000bp[6]，具有转染效率高、低细胞毒性等特点，Shu[7]等发现腺病毒载体能够有效地在哺乳动物内耳中转染不同的细胞类型，最常见的靶细胞是内耳听觉毛细胞和支持细胞，Staecker等[8]发现腺病毒载体能成功转染包括听觉毛细胞和前庭毛细胞在内的众多内耳细胞，Suzuki的研究[9]也有类似的发现，可见腺病毒载体虽然在内耳的转染效率高，但特异性不强；Luebke等[10]研究发现重组腺病毒载体能转染内毛细胞和外毛细胞，且缓慢注入比快速注入更能提高对毛细胞转染率；Staecker等[8]在其研究中还发现腺病毒载体对内耳细胞的功能没有明显的损伤，表明腺病毒载体具有低细胞毒性；但腺病毒载体在进入内耳的过程大多是有创的，常见的方法包括耳蜗造口术、圆窗穿刺给药，虽然圆窗穿刺途径比耳蜗造口术创伤小、易操作，但其对外耳的创伤依然是临床应用所不能接受的；早在2001年Jero等[11]发现明胶海绵可以在鼓室辅助腺病毒载体无创透过圆窗进入内耳，但其操作依然对外耳道和中耳损伤严重。

1.2 腺相关病毒载体

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一类单链线状DNA缺陷型病毒，作为载体其基因容量为4000-5000bp[6]，根据AAV病毒衣壳的差异已确定了12种血清型(AAV-1～AAV-12)[12]，不同血清型AAV载体对内耳转染的靶细胞不同；在耳蜗内毛细胞方面，AAV-1、2、4、5、6、7、8和9的载体主要转染内毛细胞，还可转染Hensen细胞[13,14]，而AAV-3的载体只被发现高效转染耳蜗内毛细胞，未发现转染其他内耳细胞[14]，其余类型的血清型（AAV-10、11、12）暂未发现内毛细胞的转染研究；此外，部分血清型（AAV-1～AAV9）[13-15]和重组腺相关病毒可转染外毛细胞，但外毛细胞转染效率明显低于内毛细胞；目前利用AAV载体进入内耳的给药途径有耳蜗造口术、圆窗穿刺和跨圆窗膜给药三种方式，研究发现利用腺相关病毒载体跨圆窗膜给药比耳蜗造口术、圆窗穿刺给药更安全，降低了损伤的发生几率，且跨圆窗膜给药也具有较高的转染效率，只是目前跨圆窗膜给药方式依然需要通过外科方式暴露圆窗。

1.3 慢病毒载体

慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，属于RNA逆转录病毒载体，基因容量为8000bp[6]，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体在内耳的应用研究[4,16]中表现出安全性好、转染效率高、基因表达长期稳定等特点，研究[4,17-19]发现慢病毒载体能成功转染大部分耳蜗细胞类型（包括内毛细胞、外毛细胞、上皮细胞、支持细胞），并且发现慢病毒载体在内耳转染效率高，但特异性不强；Pietola L等[17]研究发现慢病毒引起的细胞炎症反应水平低，是一种安全的载体；目前慢病毒载体内耳给药途径为耳蜗注射、跨圆窗膜给药的方式；陈文博[20]利用慢病毒载体跨圆窗膜转导白细胞介素-10（IL-10）进入内耳，发现慢病毒载体可在内耳长期稳定表达；慢病毒载体具有很好的应用前景，但靶向性不强可能限制其使用范围，而且它对外毛细胞的转染率低[16,19]。

1.4 单纯疱疹病毒载体

单纯疱疹病毒型载体，主要由I型单纯疱疹病毒（HSV-1）改造而来，基因容量为30000bp[6]，是双链线性DNA病毒载体，但单纯疱疹病毒持续表达时间较短，转导效率较低；目前，单纯疱疹病毒载体在内耳给药方式主要是以耳蜗注射为主，利用重组单纯疱疹病毒载体经注射给药进入耳蜗的研究中，主要转染了成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、Hensen细胞、Deiters细胞[4]，研究发现重组单纯疱疹病毒载体的细胞毒性较低，适合用作基因的长期载体；但是，Holt JR等[21]在研究中发现单纯疱疹病毒不能转染毛细胞；目前，有关内耳的研究中未发现该载体跨圆窗膜渗透给药方式。

1.5 牛痘病毒载体

牛痘病毒的基因组很大，该载体安全性好，基因容量为25000bp[6]，具有快速复制和分解受感染的细胞、获得高水平的病毒基因表达能力、传播细胞到细胞的能力，牛痘病毒具有广泛的感染宿主，因而是一种非常有效的DNA重组载体，且活动不受缺氧和治疗照射的影响[22]；Derby ML[4]等人利用耳蜗注射的方式将牛痘病毒载体转移到豚鼠的耳蜗细胞中，得到减少毛细胞受到伤害的结果，并主要转染了成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、间皮细胞，少量转染内毛细胞和外毛细胞；牛痘病毒虽然已被应用于内耳研究中，但相关的研究报道比较少，不是内耳研究的主要病毒载体。

综上所述，病毒载体在内耳研究中的应用特点总结参考表1。

2 纳米粒载体

纳米粒是指粒径在1～100 nm，药物可以溶解、包裹于高分子材料中形成的载体，是一种纳米级范畴的亚微粒药物载体输送系统，具有促进药物的持续释放、靶向运输、增加被载药物溶解度、改善药物吸收等特点[23,24]，特别是纳米粒可以无损渗透过圆窗进入内耳[25,26]，是一类很有应用价值的内耳药物载体；目前用于内耳药物研究的纳米粒主要有脂质体纳米粒载体、聚乳酸/乙醇酸纳米粒载体（PLGA）。

2.1 脂质体纳米粒载体

脂质体纳米粒系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体，粒径分布于20-1000nm，可以与细胞膜融合而将药物导入细胞内，进入内耳细胞后，脂质体膜能够自动降解，故对细胞没有毒性，具有极大的应用前景，脂质体纳米粒载体被认为是迄今为止最成功的细胞药物载体系统[25]，Wareing等[27]1999年首次成功使用阳离子脂质体作载体经耳蜗注射将基因转导入内耳细胞，且研究未发现任何毒性或炎症反应，说明脂质体可以作为内耳给药的安全载体，目前其作为内耳药物载体的研究比较多，研究发现脂质体载体能将药物成功转运至Claudius细胞、外毛细胞、内柱细胞、外柱细胞等内耳细胞[28]；目前，利用脂质体纳米粒作载体给药进入内耳的途径有鼓膜穿刺经鼓室缓释跨圆窗膜渗透给药、耳蜗造口术和耳蜗穿刺给药，鼓膜穿刺经鼓室缓释跨圆窗膜渗透给药方法是将载药纳米粒通过鼓膜途径注射至鼓室内，纳米粒由液相转变成凝胶状附着于圆窗外达到缓释效应，因此比耳蜗造口术和耳蜗穿刺创伤小、安全性高[25,28]。

2.2 聚乳酸/乙醇酸纳米颗粒载体

聚乳酸/乙醇酸纳米颗粒是一个带电可生物降解乳酸和乙醇酸单体组成的共聚物，是聚合物纳米颗粒，具有较高的稳定性，较高的药物运载量等优点，但水溶性较差；Ge等[29]利用聚乳酸/乙醇酸纳米粒载体跨圆窗膜将超顺磁性氧化铁导入内耳的内毛细胞、外毛细胞、支持细胞等内耳细胞，说明聚乳酸/乙醇酸纳米颗粒虽然转运效率高，但特异性不强；但Wen等[30]通过化学修饰聚乳酸/乙醇酸纳米粒表面的亲水基团，提高载体的水溶性可以增加对外毛细胞的靶向性；目前，利用聚乳酸/乙醇酸纳米颗粒作药物载体进入内耳途径有耳蜗注射、跨圆窗膜渗透给药，但研究发现跨圆窗膜给药比注射给药更高效[31]。

3 原位凝胶

原位凝胶是一种局部的药物输送系统，它具有良好的生物相容性和生物可降解性，原位凝胶在内耳药物运输应用广泛，是一种特殊的内耳药物载体；利用原位凝胶将药物经鼓膜注射入中耳，在内耳圆窗膜上形成储层效应，可有效控制药物释放进入内耳的速度，达到缓释效果[32,33]。陈钢等[34]研究发现应用泊洛沙姆407制备的原位凝胶在低于25℃时为液态，在32℃时变为半固态，该特点可被利用于保护对温度敏感的药物运输；原位凝聚作为内耳的药物载体具有制备工艺简单、毒副作用小、持续控制药物释放和微创等优点[35]，但无法控制药物进入内耳后的生物行为，对内耳细胞的靶向性差。

表1 耳蜗不同输送病毒载体的特点比较Table 1 cochlear delivery of different viral vector comparison

4 蛋白质载体

目前，利用蛋白质作载体将药物运送进入内耳的相关研究极少，Qi等[36]利用破伤风抗毒素（TAT）与双链RNA结合域构建了一种特殊的siRNA载体（TAT doublestranded RNA-binding domains，TAT-DRBDs），通过外科手术暴露圆窗，利用蛋白TAT-DRBDs结合siRNA成功跨圆窗膜渗透进入内耳，并成功导入到内毛细胞、外毛细胞等内耳细胞，而且不具有细胞毒性，该研究为内耳基因药物载体实验开拓了新的思路。

综上所述，内耳局部给药系统构建是解决内耳疾病最具应用前景的方式，该系统的构建目前面临的主要问题是创伤性，而圆窗膜的可渗透性为微创内耳给药系统的构建提供了基础，如以固体脂质体纳米和原位凝胶为载体的内耳药物系统就可以通过鼓膜穿刺鼓室储药缓释透过圆窗膜进入内耳，达到微创的目的；病毒载体是内耳疾病基因治疗的重要工具，但目前尚无发现微创性的内耳输送方法，这也是需要研究的方向。