环境内分泌干扰物对金鱼性腺组织学影响

2018-11-06王菊高广斌曹信瑜潘方艳宋元照王晓强刘少贞

山西农业大学学报（自然科学版） 2018年11期

王菊，高广斌，曹信瑜，潘方艳，宋元照，王晓强，刘少贞

(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

“环境激素”一词最早是由美国《波士顿环境》报记者安·达玛诺斯基所著《被偷去的未来》一书中提出，英语称为“Endocrine Disrupting Chemicals”(简称“EDCs”)，被译为“环境内分泌干扰物”[1]。近年来，在继臭氧层破坏、全球变暖之后，已成为全球第三大环境污染问题，被许多国家和国际组织关注[2]。它具有与生物内分泌激素作用类似的物质，如果进入动物和人体内，会起着类似于内分泌腺所分泌的激素的作用，扰乱体内激素的正常分泌，进而导致动物的生理程序发生紊乱[3]。环境激素具有种类繁多、来源广泛、长期生产、状态多样、生物富集等特点[4]。

17α-甲基睾酮(17α-Methyltesto-sterone，MT)是一种人工合成的类固醇激素[5]，被大量用于养殖业。水产养殖中使用MT来影响鱼类的性腺分化，以获得大量雄鱼，加快生长[6]；在观赏鱼养殖中也被用来改善观赏鱼的体色[7]。动物试验表明，10 μg·g-1的甲基睾酮对3月龄的红剑尾鱼的性逆转和体色影响显著[8]，而90 μg·g-1的甲基睾酮对加快黄鳝的性逆转效果显著[9]。乙炔雌二醇(Ethinylestradiol, EE2)是雌激素干扰物中的一个典型代表[10]，同时也是最具代表性的天然雌激素。其化学名称为：1,3,5-(10)-三烯-3β，化学式为C18H24O2，易溶于乙醇，可溶于丙酮、氯仿等，微溶于植物油，几乎不溶于水。有试验表明，EE2会推迟斑马鱼胚胎的发育，使斑马鱼胚胎畸形(体轴弯曲、心包水肿及色素沉着)甚至死亡[11]。来曲唑(Letorzole，LE)是新一代的芳香化酶抑制剂[12]，属于人工合成条件下的苄三唑类衍生物。有研究表明，芳香化酶可以选择性催化雌激素合成的最后一步，而对于芳香化酶的有效抑制，可以在对其它甾体激素的生物合成不产生任何影响的情况下，专门降低雌激素的水平，从而影响卵巢的发育[13]。来曲唑在疗效、经济学一级安全性上的优越性已经为多项临床研究所证实。还有研究显示，来曲唑在抑制雌激素的同时，可以导致雄激素在体内的含量升高，即间接抑制了雄激素向雌激素转化[14]。

金鱼(Carassiusauratus)作为一种极为常见的观赏鱼，有很多优势[15]。我国以鲤科鱼类为主，选用金鱼更具有代表性，它个体较小，易于繁殖和饲养，对水环境敏感，水中污染物达到一定程度就会引起中毒反应，满足了普通生物学试验的研究需要和试验数据统计分析的基本需求。本次试验以激素为药物暴露未性成熟鱼，通过观察金鱼精巢和卵巢形态学变化、对试验数据进行显著性差异分析，探讨3种环境激素对金鱼性腺的影响，为环境激素对水生生物的影响提供更多的理论基础，也为寻找环境监测的敏感水生生物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

金鱼购自山西省晋中市太谷县花鸟鱼虫市场，同一批3月龄幼鱼。在试验室饲养驯化7 d，使其适应试验室的物理环境后，选取体型匀称且体表无明显的机械损伤、人为损伤，有活力的健康个体作为试验材料。试验所用的金鱼体长为(4.39±0.5)cm，体重为(2.35±0.35)g。

1.2 试验试剂及仪器

17α-甲基睾酮药剂，乙炔雌二醇药剂，来曲唑药剂，冰醋酸、苦味酸、无水乙醇、二甲苯等试剂，显微镜成像系统(RCH1-NK50i)，石蜡切片机(LeicaRM2245)。

1.3 试验设计

试验共设3组处理组，依据不同化学药品的各自属性以及前人的研究设置合理的浓度梯度[14]，以及一个(0.001%(v/v))无水乙醇溶剂作为对照组。对照组与各试验组均设置3个重复，每组10尾金鱼。每天定时定量的投放饲料，对试验鱼的健康状况及活力进行观察记录，及时将各组鱼缸中已死亡的试验鱼捞出。使水温保持恒定在(25±1)℃范围内，光周期14 h∶10 h，半静水暴露，每天定时换水，使用充气泵增氧以保持水中的容氧量。

1.4 取样及生物学指标测定

金鱼经过激素处理后，对对照组和处理组的金鱼进行解剖及组织取样。每次从鱼缸中随机地捞取5尾鱼，将其体表的水分用吸水纸吸干，然后测量其体长、体重，同时做好记录，随后迅速摘取其性腺进行称重记录，快速置于Bouin’s固定液中固定备用。

其中性腺指数(GSI)的计算公式为：性腺指数=[性腺重(g)/体重(g)]×100%。

1.5 石蜡切片的制作

金鱼的性腺首先用波恩氏液固定48 h，将用纱布包裹的组织自来水冲洗12～24 h后，使用95%，85%，75%梯度浓度的乙醇脱水，用二甲苯透明；经过软蜡(熔点为54～56 ℃)和硬蜡(熔点为56～58 ℃)进行组织浸蜡，然后用硬蜡包埋，蜡块过夜使其充分凝固后进行蜡块的修理，切片，制成6组织连续的蜡带，在蒸馏水中进行展片、贴片、烘箱里进行烘片后使用苏木精-伊红(H-E) 染色，中性树胶封片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.6 数据处理

性腺指数采用：平均值±标准差(mean±SD)的形式表示。利用spss统计软件中的T检验进行显著性分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 17α-甲基睾酮对金鱼性腺组织学的影响

2.1.1 生物学指标变化

由表1可见，金鱼在不同浓度的MT中暴露3 d时，雄性处理组未发生显著变化，雌性200 ng·L-1处理组的体重显著低于对照组(P<0.05)。暴露7 d时，雌性处理组与对照组相比无显著变化，雄性200 ng·L-1处理组的体长和体重显著高于对照组(P<0.05)。而对于金鱼的性腺指数而言，MT处理组与对照组相比，并没有发生显著变化。

注: 表中的数据均以mean ± SD的形式进行显示，星号(*)代表与对照组之间存在显著差异(P< 0.05;)，其中向上的箭头(↑)表示平均值升高，向下的箭头(↓)表示平均值降低，没有箭头和星号的数据表示与对照组无显著的差异。

Note: The data in the table are all shown as mean ± SD. The asterisk (*) represents a significant difference from the control groups (P< 0.05;), with the upward arrow (↑) indicating the average increase and the downward arrow(↓) indicating the average decreases, the data with arrows and asterisks indicate no significant difference from the control groups.

2.1.2 性腺组织学的变化

经过3 d、7 d的MT暴露后摘取未性成熟的金鱼性腺制作切片，H-E染色后进行性腺的组织学观察。摘取得到的性腺大多为精巢，少部分为卵巢。经观察，对照组的金鱼卵巢发育良好，初级卵母细胞(Poc)和次级卵母细胞(Coc)在整个卵细胞中所占比例正常(图1-1A，2A)；暴露3 d的50 ng· L-1处理组初级卵母细胞(Poc)和次级卵母细胞(Coc)所占比例未发生显著变化(图1-1B)，7 d处理组初级卵母细胞(Poc)的数量略有所增多(图1-2B)；在100 ng·L-1中暴露3 d的处理组初级卵母细胞(Poc)所占比例未发生显著变化(图1-1C)，7 d处理组未成熟的卵细胞(Poc和Coc)比例明显增多(图1-2C)；暴露3、7 d的200 ng·L-1处理组中观察到初级卵母细胞(Poc)和次级卵母细胞(Coc)数量均明显增多(图1-1D，2D)。对照组的金鱼精巢发育良好，成熟精子(SZ)和次级精母细胞(S)在细胞中均存在且所占比例正常(图1-1E，2E)，暴露3、7 d的处理组在50 ng·L-1时成熟精子(SZ)所占比例未发生太大变化，但是7 d时出现了细胞空泡化(V)的现象(图1-1F)；暴露3、7 d的100 ng·L-1处理组中成熟精子(SZ)所占比例均有所减少，未成熟的精细胞(S)比例有所增多(图1-1G，2G)，在7 d中依然可以观察到空泡化(V)的存在；在200 ng·L-1的处理组中成熟精子(SZ)接近于无，次级精母细胞(S)的比例大大增加(图1-1H，2H)，3 d处理组出现了细胞空泡化(V)的现象(图1-1H)。

图1 MT暴露后的性腺组织学观察Fig.1 Photomicrographs of transverse ovary sections of G. rarus unexposed and exposed to MT 注：H-E染色，标尺为150 μm，1 A、2A为对照组卵巢；1B和2B、1C和2C、1D和2D分别为50、100、200 ng·L-1的MT暴露3、7 d的卵巢；1E、2E为对照组精巢；1F和2F、1G和2G、1H和2H分别为50、100、200 ng·L-1的MT暴露3、7 d的精巢。Poc为初级卵母细胞，Coc为次级卵母细胞(卵黄前期卵细胞)；SZ为成熟精子，S为次级精母细胞，V为空泡化。 Note：Hemotoxylin and eosin stain, Scale bars, 150 μm,1A and 2 A,the ovary of control female fish; 1B and 2B, 1C and 2C, 1D and 2D while the days are 3 and 7days,the ovary of the concentration of MT is 50, 100, 200 ng·L-1;1E and 2E,the ovary of control male fish; 1F and 2F, 1G and 2G, 1H and 2H while the days are 3and 7days, the ovary of the concentration of MT is 50, 100, 200 ng·L-1.Poc,perinucleolar oocyte, Coc,cortical alveolus stage; SZ, spermatozoa; S, spermatocyte; V, vacuolation.

2.2 乙炔雌二醇对金鱼性腺组织学的影响

2.2.1 乙炔雌二醇对金鱼性腺组织学的影响生物学指标变化

表2是分别以0、50、100、200 ng·L-1的 EE2处理金鱼3、7 d后，不同性别的金鱼的体长、体重及性腺重的结果。不同EE2浓度处理的雄性金鱼体重和性腺重均受到了抑制，50 ng·L-1的EE2 处理金鱼7 d后，变化差异最为明显。不同EE2浓度处理的雌性金鱼体重和性腺重均受到了促进，100 ng·L-1的EE2 处理雌性金鱼后，变化差异最为明显。

表2 EE2不同暴露时间金鱼的相关生物学指标测定结果Table 2 EE2 different exposure time of G. rarus related biological indicators measured results

2.2.2 性腺组织学变化

乙炔雌二醇暴露雌性金鱼3、7 d，从石蜡切片结果可以看出，对照组中的金鱼卵巢发育良好，在整个卵巢细胞中有正常数量的初级卵母细胞(Poc)和次级卵母细胞(Coc)存在(图2-1A，2A)，50 ng·L-1的 EE2处理3、7 d的试验组，未成熟卵细胞(Poc和Coc)的比例略有所增加，未发生显著变化(图2-1B，2B)；在浓度为100 ng·L-1的 EE2 暴露3 d后，金鱼卵巢里未成熟卵细胞(Poc和Coc)数量有所增加(图2-1C)，暴露7 d后的处理组未成熟卵细胞(Poc和Coc)数量显著增加，尤其是初级卵母细胞(Poc)(图2-2C)；当EE2的使用浓度达到 200 ng·L-1时，卵巢中初级卵母细胞(Poc)占整个卵巢细胞的比例最大(图2-1D，2D)，几乎观察不到次级卵母细胞(Coc)。在浓度分别为0、50、100和200 ng·L-1的EE2暴露 3、7 d精巢中可以观察到成熟精子数量明显下降(图2-1E-1H，2E-2H)，对照组的金鱼精巢发育良好，成熟精子(SZ)和次级精母细胞(S)在精细胞中均存在且所占比例正常(图2-1E，2E)；暴露3、7 d的处理组在50 ng·L-1时成熟精子(SZ)所占比例有所减少，未成熟的精细胞(S)比例有所增多(图2-1F，2F)；在100 ng·L-1中成熟精子(SZ)所占比例明显减少，均且出现了细胞空泡化(V)的现象(图2-1G，2G)，暴露7 d时现象尤其明显；在200 ng·L-1中成熟精子(SZ)接近于无，次级精母细胞(S)的比例大大增加，暴露7 d依然可以观察到空泡化(V)的存在(图2-2H)。

2.3 来曲唑对金鱼性腺组织学的影响

2.3.1 生物学指标变化

如表3数据所示，0、100、200、400 ng·L-1的来曲唑处理金鱼性腺组织7、14 d后，对于卵巢来说，与对照组相比，各浓度的性腺指数均减少。暴露7 d后，100 ng·L-1的处理组性腺重与性腺指数显著下降，400 ng·L-1处理时体重有所下降，暴露14 d后体重与性腺重没发生显著变化，仅在200 ng·L-1处理时性腺指数有所下降。由此可以表明，LE对于雌鱼的卵巢的分化具有抑制作用，并且在100 ng·L-1处理时，抑制作用最为明显。对于精巢的处理中，观察到在一定浓度范围内性腺指数与对照组相比增加的情况，暴露7 d后，200 ng·L-1的试验组性腺重与性腺指数显著上升，400 ng·L-1处理时体重显著上升，暴露14 d后体重与性腺重没发生显著变化，仅在400 ng·L-1处理时性腺指数有所上升，说明一定浓度的来曲唑可以促进精巢发育，在中等浓度200 ng·L-1时促进作用最为明显。

2.3.2 性腺组织学的变化

如图所示，0、100、200、400 ng·L-1来曲唑处理雌鱼卵巢7、14 d，可以看出，对照组中金鱼卵巢发育正常，存在比例正常的初级卵母细胞(Poc)和次级卵母细胞(Coc)(图3-1A，2A)；在浓度为100 ng·L-1，暴露7 d的金鱼卵巢初级卵母细胞的数量略微增多(Poc)，次级卵母细胞(Coc)数量略微下降(图3-1B)，暴露14 d的处理组初级卵母细胞的数量显著增多(Poc)(图3-2B)；在200 ng·L-1时，暴露7 d的处理组则可以明显的看到次级卵母细胞(Coc)的数量接近于无，而初级卵母细胞(Poc)的数量大量增加(图3-1C)，暴露14 d的处理组与对照组相比无明显变化(图3-2C)；暴露7、14 d的处理组，400 ng·L-1处理组与200 ng·L-1处理组相比则无明显变化(图3-1D，2D)，由此可以得出，在金鱼的卵巢的分化过程中，LE的存在对于卵巢的发育有抑制作用，200 ng· L-1时对于金鱼的卵巢发育的抑制作用最显著，LE对于卵巢的抑制作用不随浓度的升高呈线性变化。对照组中精巢发育正常，存在大量的成熟精子(SZ)(图3-1E，2E)，成熟精子(SZ)的数量与未成熟精子(S)的数量比例正常；暴露7 d后100 ng·L-1的处理组出现了空泡化现象(V)(图3-1F)，暴露14 d后，成熟精子(SZ)的数量有所下降(图3-2F)；暴露7 d后200 ng·L-1处理组中成熟精子含量大大增加(图3-1G)，处理14 d后，处理组中成熟精子含量也明显增加(图3-2G)；而400 ng·L-1处理组与200 ng·L-1处理组相比，精子含量增加并不明显(图3-1H，2H)。由此可以得出，来曲唑LE 对于金鱼精巢的分化具有促进作用，并且在200 ng·L-1时对于精子的促进作用最强。

表3 LE不同暴露时间金鱼的相关生物学指标测定结果Table 3 LE exposure time of G. rarus related biological indicators measured results

3 讨论与结论

本研究采用3种不同浓度的环境激素处理未性成熟的金鱼，对金鱼的体长、体重及性腺重3项生长性状指标进行测量及数据统计分析，用光学显微镜观察处理组与对照组的性腺组织学变化，以此研究不同浓度效应、时间效应对金鱼性腺发育的影响。

试验结果表明，MT处理金鱼3 d后，金鱼的卵巢及精巢没有表现出明显变化，而在处理7 d后，金鱼的卵巢及卵细胞的生长和发育受到不同程度的影响，随着MT暴露浓度的增加，受到的影响逐渐加重，这与之前研究麦穗鱼暴露MT后性腺组织学的研究结果一致[16]，前人的研究结果表明：在一定的浓度范围内，MT表现出来的特征与雄激素的作用类似，在雌性稀有鮈鲫的卵巢中出现了许多成熟的精细胞，改变了部分稀有鮈鲫的性别[17]，但是本研究没有出现这种现象，很可能是由于所选鱼的成熟度、设置的浓度不同，激素处理时间太短所致，所以本试验只能观察到MT在7 d里对金鱼产生了一定的影响，使卵巢中金鱼未成熟的卵细胞数量增多。前人的研究结果发现，MT能使VTG的含量下降[18]，动物试验表明，MT能够对日本青鱂幼鱼、斑马鱼幼鱼和罗非鱼体内卵黄蛋白原(VTG) 产生影响，且MT 能显著地减少鱼体内的 VTG 含量，可以推测出MT通过抑制机体内卵黄蛋白原的合成抑制雌性鱼体生殖系统的发育[19，20]，因此我们推测，MT是通过抑制体内的卵黄蛋白原的合成来影响金鱼雌鱼的发育的。本次试验表明MT对金鱼的精巢有着一定程度的促进作用，有学者研究发现，MT在浓度380 ng·L-1的时候，青鳉的精巢出现精卵巢现象[21]，本次试验未出现这种情况，很可能是因为设置的浓度梯度还不太合理，导致结果并不太明显。

图3 LE暴露后的性腺组织学观察Fig.3 Photomicrographs of transverse ovary sections of G. rarus unexposed and exposed to LE 注：H-E染色，标尺为150 μm，1 A、2A为对照组卵巢；1B和2B、1C和2C、1D和2D分别为100、200、400 ng·L-1的LE暴露7和14 d的卵巢；1E、2E为对照组精巢；1F和2F、1G和2G、1H和2H分别为100、200、400 ng·L-1的LE暴露7和14 d的精巢。Poc为初级卵母细胞，Coc为次级卵母细胞(卵黄前期卵细胞)；SZ为成熟精子，S为次级精母细胞，V为空泡化。Note：Hemotoxylin and eosin stain, Scale bars, 150 μm,1A and 2 A,the ovary of control female fish; 1B and 2B, 1C and 2C, 1D and 2D while the days are 7 and14 d the ovary of the concentration ofLE is 100, 200, 400 ng·L-1;1E and 2E,the ovary of control male fish; 1F and 2F, 1G and 2G, 1H and 2H while the days are 7and 14days the ovary of the concentration of LE is 100, 200, 400 ng·L-1.Poc,perinucleolar oocyte, Coc,cortical alveolus stage; SZ, spermatozoa; S, spermatocyte; V, vacuolation.

试验对金鱼进行为期3、7 d的浓度梯度为0、50、100、200 ng·L-1EE2处理，通过记录金鱼处理前后的体长、体重和性腺重，处理数据并对结果进行分析研究。石蜡切片分析得知，相同暴露时间下，当EE2浓度不断提高时，精巢中的精子数目显著下降。前人研究显示，在一定剂量范围内，EE2具有显著的雌性激素特点，促进了雌性中华鲟卵细胞的发育成熟，使得机体内成熟卵细胞占整个卵巢细胞的比例提高，初级卵母细胞和次级卵母细胞所占比例减小[22]，但在本次对雌性金鱼分别进行浓度为0、50、100、200 ng·L-1EE2暴露3、7 d后，在处理组和对照组的对比之下整体变化并不明显，仅在100的 EE2暴露金鱼7 d后性腺重发生了显著上升，金鱼的体重在EE2处理组的作用下也没有明显的变化，造成这种结果的原因可能是有激素处理时间较短，EE2浓度梯度跨度过大。

EE2能促进合成用于机体不同组织发育的DNA、RNA以及生物组织系统内需要的多种具有不同作用的蛋白质[23]。雌激素治疗剂常用于治疗女性性腺功能残缺、双侧卵巢切除术后修复、转移性乳腺癌、萎缩性阴道炎等[24]。与EE2作用机制相反，MT是抗雌性激素，在一定的浓度范围内，其具有显著的雄性激素特点，动物试验表明，EE2通过降低大鼠体内γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的浓度使得GABA对大鼠分泌促性腺激素(GTH)的刺激作用降低[25]。雌二醇治疗剂常用于治疗晚期前列腺癌，摘除男性睾丸后再加以雌激素治疗，可以显著缓解症状，使得病人的病痛得以减轻[26]。Harikrishnan Thilagam等人的研究表明幼年的成年日本鲈鱼在17β-雌二醇溶液中暴露3 d后，其试验组与对照组相比，免疫球蛋白和各种白细胞的数目及水平发生了显著的上升，证明了17β-雌二醇对幼年、成年日本鲈鱼的暴露会引起其免疫应答的发生，并可能对免疫系统的功能产生一定影响[27]。

本试验中，通过设置LE不同浓度、不同时间对金鱼的精巢、卵巢组织学影响以及性腺指数值分析，可以得到，LE在低浓度100 ng·L-1时，对于卵巢分化有明显的抑制作用，随着浓度的增加，对于卵巢作用的整体趋势仍然是抑制，但相比在100 ng·L-1时的抑制作用，却显得较弱，且并没有很好的体现出时间的作用效应；对精巢分化而言，LE则有明显的促进作用，可以加快雄性金鱼的精巢的分化，可以应用于雄鱼的性腺发育。在李广丽等[28]的研究中发现，来曲唑作为芳香化酶抑制的一种，对于卵巢的抑制作用主要是对于雌激素产生的抑制作用，从而抑制了卵巢的发育；而对于精巢的促进作用主要是通过抑制雄激素向雌激素转化或者时由于对于雌激素产生的抑制作用而导致的雄性激素增加，该条件直接刺激原始生殖细胞的产生和分化，从而加快了精巢分化的进程。有研究表明，芳香化酶可以分为脑型芳香化酶和性腺型芳香化酶，这2种酶分别由基因CYP19B和基因CYP19A进行编码[29]，并且，这2种芳香化酶呈特异性表达。由此，依据芳香化酶的特异性表达，可以通过不同的渠道，控制芳香化酶表达，从而控制相关激素的合成，使得激素作用的腺体的分化受到抑制。在非哺乳动物中有研究表明，芳香化酶在鱼体中具有控制其性别分化的作用，例如，对于暗纹东方鲀、硬骨鱼等的研究[30]。在对于哺乳动物的研究中，来曲唑主要是以补喂的形式研究其对于哺乳动物的影响。在对公牛的研究中显示，来曲唑主要是通过提高公牛体内内源性雄激素的含量，降低其雄二醇和雌酮含量，由此可以推测LE可能通过抑制金鱼体内的雄二醇和雌酮含量来抑制金鱼性腺的发育。在对于老鼠的致癌研究试验中显示，来曲唑的药物作用于雄鼠而言，没有较大的作用，但是对于雌鼠，可以使雌鼠得肿瘤疾病的几率降低。对于人类的病例应用表明，来曲唑通过口服即可吸收和利用，并且起到很好的药效，与同类的药物相比，具有对芳香化酶的高度选择性、半衰期长、治疗有效率高，对身体其他部位的副作用小等更多优势。综上所述，芳香化酶抑制剂来曲唑对于雌鱼卵巢发育的抑制作用可能是由于抑制了雌激素而导致的，LE的应用对于预防雌鱼的癌变疾病可能会有积极作用，具体作用方式及作用条件还有待进一步研究，而对于雄鱼精巢发育具有促进作用，可能是通过抑制雌激素的产生导致的，LE在雄鱼的应用还尚未清楚。

性固醇类激素在鱼类性腺发育成熟过程中起着重要作用，1969年，日本学者Ynla amot和Kjas hiam则首次对鱼类的性别决定机制进行了系统的阐述，总结了鱼类的性腺类型、雌雄同体的现象、性别决定的遗传学基础以及性固醇类激素对性别分化的影响，提出类固醇激素是自然的“性诱导剂”，雌激素扮演着“雌性诱导”的角色，雄激素扮演着“雄性诱导”的角色，而国内也有学者有与此类似的研究报道[31]。总之，3种环境内分泌干扰物对金鱼的性腺产生了不同程度的可见影响，本文仅选用2个不同时间段内暴露的金鱼，并未对其余更短或更长时间段内EDCs对金鱼性腺组织形态做更深入的研究，同时由于试验时间较短并未观察到生殖细胞在功能上发生异常以及深入剖析是否具有遗传毒性，激素在雌雄金鱼体内的机理还有待进一步的研究和探索。