邻香草醛缩壳寡糖席夫碱及其Cu(Ⅱ)配合物与DNA的相互作用

冯小强, 李小芳, 朱元成

(天水师范学院 化学工程与技术学院, 甘肃 天水 741001)

由于防癌、 抗肿瘤药物的药效发挥与脱氧核糖核酸(DNA)之间存在的嵌插结合方式有关[1], 因此, 研究药物与DNA之间的作用机制对寻找抗肿瘤药物意义重大. 甲壳素在自然界中含量丰富, 可从甲壳类动物外壳、 节肢动物表皮等生物组织中提取. 壳聚糖是甲壳素脱N-乙酰基后的产物, 低分子量壳聚糖又称壳寡糖, 具有广谱抑菌性和抗癌活性[2]. 壳聚糖能减小原发性黑色素瘤细胞A375粘连, 有效抑制细胞SKMEL28的繁殖, 对转移性黑色素瘤细胞RPM17951有较好的促凋亡作用, 并能抑制半光天冬酶, 即壳聚糖可通过线粒体影响细胞凋亡, 是一种有潜质的抗黑色素瘤靶向药物[3]. 文献[4]通过离子交联制备并研究了姜黄素/5-氟尿嘧啶负载硫脲壳聚糖纳米粒子(CPC-TCS-NPs/5-FU-TCS-NPs)对结肠癌细胞(HT29)的抑制活性, 发现5-FU-TCS-NPs和CRC-TCS-NPs具有较好的生物相容性, 对HT29的抑制力分别较姜黄素和5-氟尿嘧啶提高了2.5～3倍; 文献[5]将姜黄素和5-氟尿嘧啶分别与N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒子(N,O-CMC NPs)混合, 得到复合纳米药物5-FU-N,O-CMC NPs和CUR-N,O-CMC NPs, 发现它们具有良好的生物相容性, 对HT29的抑制效果较姜黄素和5-氟尿嘧啶均有提高.

邻香草醛与胺缩合生成的Valen类席夫碱具有较好的抗菌活性, 邻香草醛提供了配位能力较强的氧, 因而可得到结构更丰富、 种类更多的配位化合物[6-8]. 本文利用邻香草醛和壳寡糖反应生成的席夫碱, 与不同物质的量比的Cu2+配位合成配合物, 并采用循环伏安法、 紫外-可见吸收光谱、 DNA黏度和熔点测定, 分析席夫碱及其配合物与DNA之间的作用机制, 为设计高效抗癌药物提供有益参考.

1 实 验

1.1 试剂与仪器

氯化铜(分析纯, 西安化学试剂厂); 鲱鱼精DNA(美国Sigma公司); 壳寡糖(相对分子质量<5 000, 济南海得贝海洋生物工程有限公司); 邻香草醛(分析纯, 上海中秦化学试剂有限公司). UV-2450型紫外-可见分光光度计(UV-Vis, 日本岛津公司); SP-752型紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); CHI660B型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司); Spectrum One3.0型Fourier红外光谱仪(FT-IR, 美国Perkin Elmere公司).

1.2 席夫碱及铜配合物的制备

1.3 配合物与鲱鱼精DNA之间的作用

通过循环伏安法、 紫外吸收光谱、 DNA的黏度及熔点测定, 考察配合物与鲱鱼精DNA之间的相互作用, 实验过程参见文献[9-10].

2 结果与讨论

2.1 循环伏安法

VCOS-Cu13(A)和VCOS-Cu31(B)的循环伏安曲线如图1所示. 由图1可见: 当扫描速率v=0.1 V/s时, 席夫碱VCOS未出现氧化还原峰, VCOS-Cu13分别在0.073,0.425 V处出现2个较强的氧化峰, VCOS-Cu31分别在-0.023,0.401 V处也出现2个明显的氧化峰, 但还原峰均较弱, 表明VCOS与Cu2+参与配位反应; 随着扫描速度的逐渐增大, VCOS-Cu13和VCOS-Cu31的氧化峰电位发生正移, 氧化峰电流Ipa也随之增大.

(A) 1～14扫描速率v分别为0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7 V/s; (B) 1～10扫描速率v分别为0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 V/s.图1 VCOS-Cu的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammograms of VCOS-Cu

图2 Ipa-v的关系曲线Fig.2 Relationship curves of Ipa-v

在实验设定的扫描速率范围内,Ipa-v的关系曲线如图2所示. 由图2可见, 配合物VCOS-Cu13和VCOS-Cu31的氧化峰电流分别与扫描速率间存在线性关系, 表明两种配合物在玻碳电极上的反应均由吸附过程控制[11]. VCOS-Cu31(A)和VCOS-Cu13(B)的循环伏安曲线如图3所示. 在4 mL 1×10-4mol/L的配合物溶液中, 用1×10-5mol/L的DNA滴定, 作用10 min后未出现新峰, 但峰电流降低. 设定扫描速度为0.5 V/s, 当滴加DNA的体积为120 μL时, 配合物VCOS-Cu13在0.288 7 V附近的氧化峰正移至0.377 V处, 峰电流从-3.702×10-5A升至-2.008×10-5A； VCOS-Cu31在0.460 6 V附近的氧化峰正移至0.486 V处, 峰电流从-1.941×10-5A升至-1.485×10-5A, 但这两种配合物的还原峰电位位移均不明显. 若药物小分子与DNA之间存在插入结合, 则会使小分子的峰电位发生正移, 同时峰电流有减小趋势[12]. 由图3可见, VCOS-Cu13和VCOS-Cu31均以嵌插方式与DNA作用, 形成了非电活性的复合物， 且加入DNA后, 药物小分子的氧化还原峰电流的减小程度、 峰电位的正移程度与DNA嵌插结合程度呈正相关, 即小分子的氧化还原峰电流下降越多， 峰电位的正移趋势越明显, 小分子与DNA的嵌插结合力越强. VCOS-Cu13与DNA的作用较VCOS-Cu31强, 这可能是由于配合物VCOS-Cu13中含有的金属Cu2+离子数量较多, 电子云密度较高, 更利于与DNA结合所致, 即Cu2+含量越大, 配合物与DNA的结合越容易、 越稳定.

c(配合物)=1×10-4 mol/L; 1～5: 加入DNA溶液的体积分别为0,60,80,100,120 μL.图3 配合物的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of complexes

图4 1/(Δ Ipa)与1/c(DNA)的关系曲线Fig.4 Relationship curves of 1/(Δ Ipa) and 1/c(DNA)

2.2 紫外-可见吸收光谱法

席夫碱及两种铜配合物在加入DNA前后的紫外-可见吸收光谱如图5所示. 由图5可见： 在浓度为0.1 mmol/L的席夫碱及铜配合物中依次加入DNA后, 特征吸收峰的峰位呈明显红移趋势, 吸收峰强度发生不同程度的变化; 在加入300 μL DNA后, VCOS原位于201.4 nm处的吸收峰逐渐消失, 原位于228.8 nm处吸收峰峰位红移0.6 nm, 增色47.85%, 原位于277.8 nm处吸收峰峰位红移14.2 nm, 增色35.15%； VCOS-Cu13原位于201.6 nm的吸收峰减色11.25%, 峰位红移25 nm, 但在290 nm附近出现一个新的吸收峰, 且强度随DNA加入量的增大而增强； VCOS-Cu31原位于202.0 nm的强吸收峰减色48.68%, 峰位红移20 nm, 原位于276.4 nm的强吸收峰增色22.82%, 峰位红移10.2 nm. 小分子的吸收光谱出现红移现象和减色效应可作为小分子与DNA发生嵌插结合的依据[13], 进一步证明席夫碱及两种铜配合物以嵌插方式与DNA发生相互作用.

c(配合物)=1×10-4 mol/L; c(DNA)=1.0×10-5 mol/L; 1～4: 加入DNA溶液的体积分别为0, 100, 200, 300 μL. 图5 配合物的紫外-可见吸收光谱Fig.5 UV-Vis absorption spectra of complexes

2.3 黏度法

设定DNA的浓度不变, 向DNA溶液中依次加入席夫碱或配合物后, DNA的相对黏度增大, 且黏度增大程度与席夫碱或配合物的浓度呈正相关, 如图6所示. 若外来小分子与DNA之间存在嵌插, 则DNA溶液的黏度会增加[14]. 可见, 配合物以嵌插方式与DNA作用, 从而使DNA双螺旋链伸长, 黏度增大.

2.4 DNA熔点的测定

席夫碱及配合物对DNA熔点可产生不同程度的影响, 结果如图7所示. 由图7可见, 单独DNA的变性温度为70 ℃， 分别与VCOS,VCOS-Cu31和VCOS-Cu13结合后, DNA的变性温度分别升至71.2,73.4,80 ℃, 配合物与DNA的嵌插作用会导致DNA熔点升高, 且升高幅度与结合强度呈正相关[15-16]. DNA熔点测定实验结果表明, VCOS,VCOS-Cu31和VCOS-Cu13均可嵌入DNA的碱基对中, 使DNA稳定性升高, 其中VCOS-Cu13嵌入DNA碱基对的能力最强, VCOS最弱.

图6 配合物对DNA黏度的影响Fig.6 Effects of complexes on viscosity of DNA

图7 配合物对DNA熔点的影响Fig.7 Effects of complexes on melting point of DNA

综上可见, VCOS-Cu31和VCOS-Cu13配合物具有电化学活性, 当扫描速率为0.025～1.0 V/s时, 配合物在电极上的反应过程主要由吸附过程控制. 向其中加入DNA后, 配合物的氧化峰电流减小, 峰电位正移. 配合物在加入DNA后, 其吸收峰的峰位发生红移, 吸光强度显著减色. 同时, DNA的相对黏度和熔点在加入配合物后均有增大趋势. 实验结果表明： 配合物VCOS-Cu31和VCOS-Cu13均以嵌插结合模式与DNA作用, 但嵌插程度较弱; VCOS-Cu13和VCOS-Cu31与DNA均可形成1∶1(物质的量比)的配合物, 结合常数分别为0.78×104,0.69×104L/mol.