中国实验动物中结肠小袋纤毛虫快速鉴定及感染调查

高正琴

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

新出现的原生动物病原体已经成为人类健康的主要威胁。在过去的二三十年里，导致人类疾病的原生动物病原体的数量一直在上升。免疫缺陷患者数量的显著增加、国际旅行的增加、森林砍伐和广泛的城市住所是导致原生动物疾病流行病学变化的一些因素。结肠小袋纤毛虫是引起痢疾的重要原因，特别是在免疫系统受损的人群中，结肠小袋纤毛虫可能成为一种重要的病原体。结肠小袋纤毛虫(balantidiumcoli)寄生于宿主结肠，感染引起结肠小袋纤毛虫病(balantidiosis)，呈世界性分布，主要流行于热带和亚热带地区，大多数人类病例都来自南美和中美洲、中国、伊朗、印度尼西亚、菲律宾、新几内亚和太平洋岛屿。目前已知包括人在内的多种动物如猪、猩猩、猴、大鼠、豚鼠、马、牛、羊、鸵鸟、鹰等均可感染，感染的范围从无症状、轻微腹泻到血粪和暴发性痢疾。在急性疾病中，可能每20 min就发生一次暴发性腹泻。在极少数情况下，结肠小袋纤毛虫也会侵犯其他器官，这在免疫缺陷患者中更常见[1～12]。

目前，国内实验动物的结肠小袋纤毛虫感染概况在很大程度上是未知的。至今尚未见不同方法检定实验动物结肠小袋纤毛虫的具体研究及感染报道。本研究首次采用实时动态显微技术(real-time dynamic microscopy technique)和聚合酶链反应(polymeras chain reaction，PCR)及测序技术(sequencing technique)，对国内实验动物的结肠小袋纤毛虫进行快速检定和感染调查，为国家标准的修订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2012年12月～2017年12月，14 964只表观健康的实验动物(包括：猴382只，小型猪725只，犬806只，兔1 517只，地鼠422只，豚鼠1 545只，大鼠1 489只，小鼠8 053只，鸡25只)来自全国60个不同厂家。猴、小型猪、犬、兔、鸡采集新鲜粪便。豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠安乐死后采集肠道内容物[13，14]。

1.2 试剂和仪器 QIAamp DNA Stool Mini Kit，QIAamp DNA Mini Kit为德国Qiagen公司产品；nuclease-free water为美国Progema公司产品；DNA Marker，Agarose，EX Taq，dNTP Mixture为日本TaKaRa公司产品。显微镜及成像系统(Nikon，日本)；Gel Logic凝胶成像分析系统(东乐自然基因生命科学公司)；Verity 96 Thermal Cycler基因扩增仪(Applied Biosystyem，美国)；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美国)。

1.3 实时动态显微技术检测结肠小袋纤毛虫 在生物安全柜内，用生理盐水将待测粪便、肠内容物做适当处理，吸取混悬液滴片，采用实时动态显微技术检测样本中寄生虫病原体。根据虫体的形态和大小来进行虫种的鉴定。

1.4 引物设计和DNA提取 本研究针对结肠小袋纤毛虫的转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)，18S rRNA和SSU RNA(small subunit ribosomal RNA)基因区域，设计三对引物见表1。用QIAamp DNA Mini Kit提取结肠小袋纤毛虫滋养体和包囊DNA。用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取粪便和肠内容物样本DNA。

表1结肠小袋纤毛虫PCR引物序列

1.5 PCR和测序鉴定结肠小袋纤毛虫 经过长时间的研究摸索建立并优化PCR检测体系和反应条件，进行敏感度和特异度试验并应用于实验动物实际样本中结肠小袋纤毛虫检测。PCR反应体系如下：5.0 μl 10×Buffer (Mg2+Plus)，4.0 μl dNTP Mixture，各0.5 μl上下游引物，0.25 μl EX Taq，2.0 μl模板DNA，用无核酸酶水(nuclease-free water)补足至50 μl。循环参数：95℃1 min 1 cycle；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，40 cycles；72℃10 min 1 cycle。PCR结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。凝胶成像分析系统摄录试验结果。阳性样本测序鉴定。

2 结果

2.1 实时动态显微技术检测结肠小袋纤毛虫结果 可见少量巨大的卵形或椭圆形纤毛虫滋养体，不停地快速旋转运动，无色透明或浅灰略带绿色，大小为(30～200)μm ×(25～120)μm，腹面略扁平，背面隆起，表面凹凸不平，体表完全覆盖着纤毛形成密集的纵向行，虫体前端有胞口和胞咽，后端有胞肛，中后部有伸缩泡，细胞质中含有许多食物颗粒及大小不等的食物泡，有肾形大核和圆形小核(图1-A)。在一些滋养体内发现有许多内在生物，内在生物形态不规则，长度可达5 μm，能够从虫体壁形成囊泡而释放到外界(图1-B)。包囊近圆形或卵圆形，淡黄或淡绿色，直径为40～60 μm，外被两层囊膜，囊壁稍厚，囊内结构同滋养体，唯食物泡少；新形成的包囊内可见虫体仍能活动(图1-C)。依据纤毛虫滋养体和包囊的大小和形态特征，鉴定为结肠小袋纤毛虫。应用实时动态显微技术检测实验动物结肠小袋纤毛虫，结果从14 964份实验动物样本分离鉴定获得4份结肠小袋纤毛虫活体阳性样本，阳性检出率为0.03%。

图1 中国实验动物中结肠小袋纤毛虫滋养体和包囊镜检形态(A，B：滋养体；C：包囊)

2.2 PCR和测序鉴定结肠小袋纤毛虫结果 将实时动态显微技术检出的结肠小袋纤毛虫滋养体和包囊，提取DNA做PCR检测，结果在单个滋养体和包囊DNA样本中，均可检出结肠小袋纤毛虫基因ITS(300 bp)，18S rRNA(354 bp)和SSU RNA(255 bp)特异性目的片段。将测序鉴定的阳性样本基因序列实时递交NCBI，通过BLAST在线比对分析，结果发现本研究获得的实验动物中结肠小袋纤毛虫ITS，18S rRNA和 SSU RNA基因序列与GenBank中已公布的不同国家不同物种来源的结肠小袋纤毛虫ITS，18S rRNA和 SSU RNA核苷酸同源性达99%～100%(GenBank登录号为JN985904.1，AF045030.1，GQ903678.1，AY898942.1，AF029763.1)。应用PCR和测序技术检测14 964份实验动物实际样本中结肠小袋纤毛虫，结果检出4份阳性样本，阳性检出率为0.03%。这4份阳性样本均来自于豚鼠(表2)。

表2中国实验动物中结肠小袋纤毛虫感染情况

注：a) 实时动态显微技术(real-time dynamic microscopy technique)；b) PCR和测序技术(PCR and sequencing technique)。

3 讨论

感染性肠胃炎(infectious gastroenteritis，IGE)是由大量的细菌、病毒和寄生虫引起的。肠道寄生虫感染发生在世界上被边缘化、低收入和资源受限的地区，在非洲、亚洲和美洲的发展中地区有超过10亿的感染者。地球上大约有15 000个原生动物物种。结肠小袋纤毛虫是一种原生动物，它可以导致人类、猪和非人类灵长类动物的痢疾，是一种人兽共患病病原体。结肠小袋纤毛虫是人体最大的寄生原虫。该虫1857年首先由Malmsten[15]在两名痢疾病人的粪便中发现，定名为结肠草履虫(Parameciumcoli)。接着，Leukart[16]在猪的结肠中也有发现。1862年Stein[17]认为前两人所见为同一种，更名为结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)。结肠小袋纤毛虫生活史分滋养体和包囊两个发育阶段。包囊在宿主的结肠和直肠中开始形成，通常在形成的粪便中发现包囊。包囊是病原体的传播阶段。包囊壁厚不易受干燥和其他环境压力的影响。包囊在免受阳光直射潮湿的环境中生存最好。被感染性包囊污染的空气、水、食物、水果、蔬菜可造成感染传播。结肠小袋纤毛虫包囊被宿主吞食后，在胃肠道中受消化液的作用，包囊内的虫体脱囊而转化为滋养体，并下行至结肠内定居。滋养体以淀粉、细菌、肠壁细胞等为食，主要以横二分裂法进行繁殖。结肠小袋纤毛虫感染在人类中并不常见。这种有机体虽然具有致病性，但毒性较低。以下三种临床表现为：①轻度感染：导致间歇性腹泻与便秘；②急性感染：滋养体攻击肠道上皮，造成溃疡和引起血痢类似于阿米巴痢疾，可能会有头痛、发烧、恶心、呕吐、腹痛和肠道绞痛。在少数病例中，可能发生肠穿孔性溃疡，导致严重脱水、大出血休克甚至死亡；③慢性感染：间歇性腹泻与便秘交替发生，粪便中含有大量的黏液，但很少有血液。免疫抑制、长期有其他慢性疾病(如糖尿病、慢性肾病)、营养不良或肠道正常机能发生改变时，结肠小袋纤毛虫则易于侵入组织并发病。感染者肠道内的菌丛组成对该虫的寄生或致病也具有一定影响，Ros-tkawska观察发现变形杆菌、大肠埃希菌、沙门菌等对该虫的发育产生有害作用；而肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌及肠杆菌等则有促进作用。结肠小袋纤毛虫滋养体可分泌透明质酸酶及借助纤毛运动能侵及人体的多种脏器，如肝脏、肺、泌尿生殖道、阑尾等器官，引起肝脓肿、坏死性肺感染、子宫阴道炎症、尿路感染、膀胱炎、腹膜炎，侵犯肠黏膜甚至黏膜下层，引起溃疡。主要病变部位是盲肠和直肠，可延及全部结肠黏膜，偶尔也可侵及回肠末端。严重病例可出现大面积结肠黏膜的破坏和脱落[18～32]。

LI等[33]2013年5月检出中国广西壮族自治区笼养的120只恒河猴(macaca mulatta)粪便结肠小袋纤毛虫阳性率为64.2%(77/120)，据推测，在这个非人类灵长类动物中心，有下列因素导致了恒河猴的结肠小袋纤毛虫感染：①未受感染的猴子从同一笼子里的阳性猴子粪便中摄取了包囊；②水和/或食物被猫或鼠的粪便所污染；③人类和猴子之间的交叉感染。Hinde[34]收集了加勒比海灵长类动物研究中心46只圈养的恒河猴乳汁，研究发现：没有感染结肠小袋纤毛虫的母猴体内脂肪含量明显高于有结肠小袋纤毛虫感染的母猴体内脂肪含量，结果表明母猴结肠小袋纤毛虫感染和乳汁脂肪之间的联系显著。Tatfeng[35]对234只被困在不同地点(厕所、客厅、厨房和卧室)的蟑螂进行细菌、真菌和寄生虫分离，结果分离获得了结肠小袋纤毛虫、蛔虫、鞭虫、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、念珠菌、曲霉菌等病原体，因此，控制蟑螂将大大减少病原体在环境中的传播。Rivera等[36]从墨西哥30名随机挑选的女性龋齿患者的口、鼻和咽部检出了结肠小袋纤毛虫、溶组织内阿米巴等原虫。这些无症状携带者可传播此类原虫。Drakulovski等[37]在喀麦隆43只猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)阳性和71只SIV阴性的野生黑猩猩粪便中检出了结肠小袋纤毛虫、溶组织内阿米巴、迈氏唇鞭毛虫、缩小膜壳绦虫等寄生虫，这些高水平的寄生虫感染可能会给在血液中存在大量SIV病毒的动物群带来额外的负担。Kouassi等[38]报道科特迪瓦白眉猴的结肠小袋纤毛虫感染率为60.3%。Ryan等[39]报道加纳狒狒的结肠小袋纤毛虫感染率为62%。Yaghoobi等[40]报道伊朗野猪的结肠小袋纤毛虫感染率为64%。目前，国内外尚未见有关实验动物结肠小袋纤毛虫监测分析的报道，用不同方法快速检测鉴定该病原体的研究信息更少。因此，本研究调查分析了不同种实验动物携带的结肠小袋纤毛虫，识别了此寄生虫，填补了这一研究空白。本次调查中，实验动物的结肠小袋纤毛虫感染率为0.03%。综上所述，本研究对结肠小袋纤毛虫进行了感染调查和分子诊断。应用实时动态显微技术跟踪监测寄生虫，使用PCR结合基因测序技术从分子水平上对结肠小袋纤毛虫进行确认，为快速准确鉴别诊断结肠小袋纤毛虫感染提供新的思路。