柚皮苷通过调控AKT活化影响人肺癌H1299细胞增殖、凋亡和迁移

朴雪梅，杨威，金利民，李浩源

(1.吉林省延边妇幼保健院 药剂科,吉林 延吉 133001；2.吉林大学中日联谊医院肝胆胰外科，吉林 长春 130033)

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，已成为癌症相关死亡的主要原因，其预后效果差，肺癌患者的5年生存率只有15%左右，给患者的健康造成了极大的危害[1- 2]。目前，治疗肺癌的主要手段是手术、放疗以及化疗，但是化疗产生的药物耐受和严重的副作用使应用化疗药物治疗肺癌受到了很多限制。因此，寻找以及开发低毒且有效的天然药物显得日臻重要。柚皮苷属于双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科橘柑属类植物中，是一种次级代谢产物以及天然的苦味剂，其对人体毒副作用比较小[3]。已有研究报道，柚皮苷具有抗氧化、抗炎、抗细胞增殖以及抗肿瘤等多种生物学作用[4- 7]。目前，柚皮苷对宫颈癌[8]、卵巢癌[9]、肝癌[10]以及结肠癌[11]的增殖具有抑制作用，进而发挥抗肿瘤效应。研究表明，凋亡相关蛋白Bcl- 2和Bax等活化后进入线粒体，进而促进线粒体膜对细胞色素C的释放，这反过来又诱导Caspase级联反应及其底物的激活，最终导致细胞凋亡的发生[12]。细胞凋亡发生过程中，Caspase- 3是一种重要的凋亡执行蛋白。正常细胞的Caspase- 3活性很低，细胞发生凋亡后其活性明显升高[13]。柚皮苷作为一种天然低毒的抗肿瘤化合物，其在肺癌中的作用研究尚缺乏，因此本研究拟探讨柚皮苷对肺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肺癌细胞H1299购自中科院上海细胞库，柚皮苷购自南京泽朗医药公司，RPMI- 1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，Annexin V- FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自中国杭州联科生物技术股份有限公司，Transwell小室购自北京基尼亚生物技术有限公司。Bcl- 2抗体以及Bax抗体AKT和p- AKT均购自美国Cell Signaling Technology；GAPDH抗体购自北京博奥森生物公司，二抗购自武汉博士德生物公司，Caspase- 3活性检测试剂盒购自上海碧云天生物公司。

1.2 H1299细胞培养及实验分组

复苏H1299细胞后，加入含10%胎牛血清的1640完全培养基，放置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行培养。等到细胞的融合度为90%左右进行细胞传代。细胞分为对照组(NC)、10 μmol·L-1柚皮苷处理组、20 μmol·L-1柚皮苷处理组和40 μmol·L-1柚皮苷处理组。

1.3 MTT法检测定细胞增殖

取生长状态良好的H1299细胞，以每孔1 000个细胞的密度均匀接种到96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。等到细胞贴壁后用不同浓度的柚皮苷处理细胞24、48、72 h。每组设置6个复孔。药物作用终止前4 h向每孔中加入20 μl MTT(5 mg·ml-1)继续培养，4 h后用移液枪吸弃MTT，加入体积为150 μl的DMSO，放置培养箱中继续孵育30 min，在波长为490 nm的条件下用酶标仪读取每孔的吸光度值(OD值)。

1.4 流式细胞技术检测细胞凋亡

取生长状态良好的H1299细胞，以每孔3×105个的细胞密度均匀接种于6孔板中。等到细胞贴壁后用不同浓度的柚皮苷处理细胞，继续孵育24 h后，用PBS洗涤2次，1 000 r·min-1离心5 min收集细胞。用Binding buffer(500 μl)对细胞进行重悬后加入Annexin V- FITC(5 μl)和PI(10 μl)充分混匀，避光孵育5 min，用流式细胞仪进行检测。

1.5 Western blotting法检测Bcl- 2、Bax蛋白的表达

用不同浓度的柚皮苷处理细胞24 h后，按照试剂说明书对各组细胞的蛋白进行提取。使用BCA蛋白定量试剂盒测定各组蛋白浓度，配置浓度为12%的分离胶，经聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝胶电泳。电泳结束后进行湿转法转膜，电流大小恒为250 mA，时间为120 min。然后用5%脱脂牛奶对PVDF膜进行封闭。封闭结束后于4 ℃条件下，用一抗稀释液(anti- Bcl- 2,1∶1 000;anti- Bax,1∶1 000;anti- p- AKT,1∶1 000;anti- AKT,1∶1 000;anti- GAPDH,1∶1 000)对PVDF膜进行过夜孵育。用TBST洗涤PVDF膜3次(10 min·次-1)，在摇床上进行洗涤。室温孵育二抗，孵育60 min后用TBST洗涤PVDF膜3次(10 min·次-1)，在摇床上进行洗涤。最后用成像仪显影。用GAPDH作为内参，比较分析各组目的蛋白表达水平的差异。

1.6 比色皿法检测H1299细胞中Caspase- 3活性

取生长状态良好的H1299细胞，以每孔3×105个的细胞密度均匀接种于6孔板中，放于5% CO2、37 ℃条件下培养。等到细胞贴壁后，用不同浓度的柚皮苷处理细胞，继续孵育24 h。去除上清，每孔加入100 μl预冷的裂解液，放置于冰上裂解15 min。然后，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，收集上清。参照Caspase- 3活性检测试剂盒的说明书进行操作，检测细胞内Caspase- 3蛋白活性。最后，在波长为405 nm的条件下，用酶标仪读取OD值，并建立标准曲线，算出Caspase- 3活性，设对照组Caspase- 3活性为1。

1.7 细胞迁移实验

将不同浓度柚皮苷处理24 h的各细胞悬液 200 μl (细胞接种密度为1×105个·ml-1)分别加入到上室中，并用无血清培养基培养，下室则加入体积为500 μl含有10%血清的DMEM培养液。放置于培养箱内继续孵育。24 h后取出小室并移去上室内培养液。用棉棒轻轻擦去小室膜表面未穿过的细胞，用4%多聚甲醛固定细胞10 min。PBS洗涤后再用1%结晶紫染色液染色，PBS洗涤后用倒置显微镜下观察并随机选取5个视野进行拍照，计算发生迁移的细胞数。

1.8 统计学处理

本研究的实验数据用均数±标准差表示，应用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 柚皮苷对肺癌H1299细胞增殖的影响

MTT结果显示，10、20和40 μmol·L-1的柚皮苷处理H1299细胞后，其细胞活力显著降低，且呈剂量和时间依赖性，见表1。

2.2 柚皮苷对肺癌H1299细胞凋亡的影响

Annexin V- FITC/PI双染流式结果显示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)处理H1299细胞24 h可明显增加细胞的凋亡率，见图1。

2.3 柚皮苷对肺癌H1299细胞Bcl- 2、Bax蛋白表达水平的影响

Western blotting检测结果显示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)处理细胞24 h可显著降低H1299细胞内Bcl- 2蛋白表达水平(P<0.05)，Bax蛋白表达明显增加(P<0.05)。见图2。

组 别 OD值24 h48 h72 h空白对照组0.524±0.0250.703±0.0430.889±0.03110 μmol·L-1柚皮苷处理组0.375±0.016a0.425±0.027a0.513±0.053a20 μmol·L-1柚皮苷处理组0.267±0.022a0.284±0.009a0.265±0.068a40 μmol·L-1柚皮苷处理组0.195±0.065a0.137±0.025a0.109±0.046a

与对照组比较，aP<0.05

2.4 柚皮苷对肺癌H1299细胞Caspase- 3活性的影响

柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)处理细胞24 h可显著增加H1299细胞Caspase- 3活性，且随着柚皮苷浓度的增加而增加。见表2。

2.5 柚皮苷对肺癌H1299细胞迁移的影响

Transwell结果显示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)处理细胞24 h可显著抑制H1299细胞的迁移，且这种抑制作用具有浓度依赖性。见图3。

2.6 柚皮苷对肺癌H1299细胞AKT活化的影响

浓度为10、20、40 μmol·L-1的柚皮苷处理细胞24 h后，H1299细胞的p- AKT/AKT水平显著降低，表明柚皮苷抑制肺癌H1299细胞AKT的活化。见图4。

3 讨 论

柚皮苷属于天然黄酮类化合物，许多研究已证实柚皮苷具有抗细胞增殖、抗肿瘤效应[14,9]。研究进一步发现，柚皮苷的抗肿瘤作用与它的苯环取代基相关，其中位于A酚环上的糖结合物的种类发挥重要作用，B环上连有羟基也同样表现出很强的抗肿瘤效应，例如羟基连在B环上3、4和5的位置或者B环有饱和的C环和一邻位酚结构就会表现出极强的抗肿瘤生物活性[15]。研究资料显示，柚皮苷主要通过抑制癌细胞的增殖、促使癌细胞发生凋亡、抑制癌基因的表达等产生抗肿瘤作用[16]。黄酮类的抗细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用受到了广大学者的关注，很多学者对有关柚皮苷诱导细胞凋亡以及细胞发生癌变的物理和化学因子进行了一系列研究[17- 18]。Camargo等[19]研究发现，一定浓度的柚皮苷可对大鼠W256癌肉瘤的生长产生抑制作用。但是，目前柚皮苷在肺癌中的研究尚未见报道。本研究发现柚皮苷可明显抑制肺癌H1299细胞的增殖，随着柚皮苷作用浓度的增加和处理时间的延长，这种抑制作用越来越强。这表明柚皮苷可显著抑制肺癌细胞的增殖，且呈浓度和时间依赖关系。

图1不同浓度柚皮苷对H1299细胞凋亡率的影响

与对照组比较，aP<0.05, bP<0.01

图2不同浓度柚皮苷对H1299细胞Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响

组 别Caspase-3活性空白对照组1.01±0.0210 μmol·L-1柚皮苷处理组1.57±0.08a20 μmol·L-1柚皮苷处理组2.23±0.05a40 μmol·L-1柚皮苷处理组2.69±0.07a

与对照组比较,aP<0.05

与对照组比较，aP<0.05

图3不同浓度柚皮苷对H1299细胞迁移的影响

诱导肿瘤细胞发生凋亡是抗癌药物发挥效应的重要途径。AnnexinV- FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示，柚皮苷能增加肺癌H1299细胞的凋亡率，且呈剂量依赖关系。细胞凋亡的发生是受到很多相关基因调控的，如Bcl- 2家族在其中发挥重要功能。Bcl- 2是首个被发现的凋亡抑制基因，它主要位线粒体核膜和外膜等，可通过抑制细胞色素C等促凋亡分子的释放，保持细胞内钙离子的稳定，减弱自由基的堆积，抑制染色质发生浓缩和裂解，进而抑制凋亡的发生[20]。此外，Bcl- 2能够抑制线粒体释放细胞色素C，并阻止它的合成。Bax作为Bcl- 2的同源性蛋白，可发挥促进细胞凋亡的功能。它能够改变线粒体的通透性，诱导细胞色素C的释放，进而启动Caspase相关的凋亡级联反应，最终诱导细胞凋亡[21]。我们的研究结果显示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)可下调抗凋亡蛋白Bcl- 2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达。Caspase是凋亡过程的核心因子，活化的Caspase- 3能够特异性切割不同底物，对细胞质、细胞核和细胞骨架的重要蛋白质进行降解，最终诱导凋亡的发生[13]。于是，我们进一步探讨了柚皮苷对肺癌H1299细胞Caspase- 3活性的影响。结果显示，柚皮苷处理可明显增加肺癌H1299细胞Caspase- 3的活性，且随着柚皮苷浓度的增加而增加。以上结果表明，柚皮苷诱导H1299细胞凋亡可能是通过影响Bcl- 2、Bax蛋白表达水平以及Caspase- 3活性实现的。

与对照组比较，aP<0.05

图4不同浓度柚皮苷对H1299细胞AKT活化的影响

研究表明，细胞迁移与肿瘤的发生发展密切相关[22- 24]。本研究还进一步探讨了柚皮苷对人肺癌H1299细胞迁移能力的影响。Transwell结果显示，柚皮苷可浓度依赖性地抑制H1299细胞的迁移。研究报道，AKT活化在肿瘤的发生发展中具有重要作用[25]。同样，AKT活化也与肺癌的发生发展密切相关[26]。因此，本研究探也讨了柚皮苷对人肺癌H1299细胞AKT活化的影响。结果显示，柚皮苷处理H1299细胞后，其p- AKT/AKT水平显著降低，表明柚皮苷可抑制肺癌H1299细胞AKT的活化。

本研究结果表明，柚皮苷对人肺癌细胞的增殖和迁移具有抑制作用，其机制可能与其抑制AKT的活化有关，本研究的发现可为柚皮苷体外抗肿瘤机制的研究提供理论依据。